原理
硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后（即可与膜上的抗原结合），然后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而判定结果。根据所用的标记物不同，可分为：辣根过氧化物酶免疫斑点试验（使用辣根过氧化物酶作为抗抗体的标记物），碱性磷酸酶免疫斑点试验（使用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物作为酶标记物）和金银染色免疫斑点试验（使用胶体金作为抗抗体的标记物）等。其中，最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。
材料与仪器
过氧化物酶底物
PBS 甘油 DAB APAAP复合物
纤维素膜
PBS 甘油 DAB APAAP复合物
纤维素膜
步骤
一、辣根过氧化物酶免疫斑点试验
1. 将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜（或醋酸纤维素膜）上
二、碱性磷酸酶免疫斑点试验
1. 将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜上
1. 将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜（或醋酸纤维素膜）上
2. 置37 ℃温箱中干燥20～30 分钟
3. 滴加封闭液37 ℃温盒中封闭10 分钟
4. 用洗涤液洗1～2 次，滤纸吸干
5. 加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置37 ℃湿盒中30 分钟
6. 用洗涤液震洗3 次×3 分钟、吸干
7. 水洗终止反应，观察结果。出现明显综色斑点者为阳性
二、碱性磷酸酶免疫斑点试验
1. 将0.01 M PBS PH7.4 稀释的抗原液2 μl点于硝酸纤维素膜上
2. 置37 ℃温箱中干燥20～30 分钟
3. 用封闭液37 ℃湿盒中封闭10 分钟
4. 用洗涤液震洗1～2 次，滤纸吸干
5. 加稀释液稀释的小鼠抗体或待检标本，置室温湿盒中30 分钟
6. 用洗涤液震洗3 次×3 分钟，吸干
7. 加1∶50稀释的兔抗鼠IgG或羊抗鼠IgG血清，置室温湿盒中30 分钟、洗同前、吸干
8. 加APAAP复合物于膜上、室温湿盒中30 分钟，洗同前、吸干
9. 加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置室温湿盒中10分钟，震洗1次、吸干
9. 加1∶50稀释的抗鼠IgG血清，置室温湿盒中10分钟，震洗1次、吸干
10. 加APAAP复合物，温育、洗涤同“9”
11. 重复“9”和“10”1～3次
12. 洗涤液震洗3次×3分钟、吸干
13. 滴加新配底物溶液显色5～10分钟，水洗中止反应，观察结果
注意事项
一、免疫斑点试验的影响因素
1. 包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000 μg/ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
2. 酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。
3. 显色时间，一般认为5-10 分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。
4. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10 μl即可。
1. 包被N、C膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000 μg/ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。
2. 酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。
3. 显色时间，一般认为5-10 分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。
4. 用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10 μl即可。
来源：丁香实验
