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ELISA 法检测细胞凋亡

相关实验:基于生物化学检测细胞凋亡

最新修订时间:

简介

ELISA 法检测细胞凋亡是对凋亡细胞产生单/寡核小体进行高特异性、高敏感性的 定量检测。

原理

ELISA 法检测细胞凋亡的基本原理是细胞凋亡时产生的核小体可以与组蛋白 H2A、H2B、H3、H4 形成紧密复合物而不被 核酸内切酶裂解。

应用小鼠抗 DNA 和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段特异结合而 建立的双抗体夹心酶免疫法,可特异检测凋亡细胞溶解物中的核小体。

该法结合生物 素-亲和素放大系统,可实现对凋亡细胞产生的单/寡核小体进行高特异性、高敏感性的 定量检测。

材料与仪器

器材:链霉亲和素包被的微孔板,离心管,吸管,移液器等。

试剂:

① 生物素标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗体;
② 过氧化物酶 (POD) 标记的小鼠 抗 DNA 单克隆抗体;
③ DNA - 组蛋白复合物,作为对照;
④ ABTS 底物;
⑤ 溶解缓冲液;
⑥ 温育缓冲液;
⑦ 底物缓冲液。

步骤

ELISA 法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步:

A 取样品 1000 r/min 离心 10 min, 吸取 20μL 上清液,加入链霉亲和素包被的培 养板孔中。

B 加入 80μL 免疫反应试剂,含抗 DNA - POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液 (按 1:18 混合),室温下孵育 2 h (置摇床上 250 r/min)。

C 去上清,加 300μL 温育缓冲液洗涤,小心移去洗涤液。

D 重复步骤 (3) 2 次。

E 加入底物缓冲液 100 μL, 摇床上室温孵育至颜色变化至合适。

F 用底物缓冲液作空白对照,比色检测其 0D 值 (10 - 20 min 内完成),检测波长 405 nm, 参考波长为 492 nm。

G 结果分析:按以下公式计算细胞产生的单/低聚核小体片段的聚集值:



注意事项:mU (吸收值)=双孔吸收值的平均 0D 值 - 底物 0D 值。

注意事项

1. 加入底物后,尽快检测。

2. 若样品的 0D 值过高,应对样本做适当稀释后再行检测。

来源:丁香实验

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