ELISA法检测细胞凋亡

<font><b><span><span>（一）<span> </span> </span> </span> </b> <b><span>原理<span><span> </span> </span></span></b></font>

<font>细胞凋亡的发生，是由于钙<span>-</span> 镁依赖性<a href="https://www.biomart.cn/supply/1001011303.htm">核酸酶</a>进入核小体间切割<span><b>DNA</b> ,</span> 产生<span>180bp</span> ～<span>200bp</span> 或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白<span>H2A</span> 、<span>H2B</span> 、<span>H3</span> 和<span>H4</span> 形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗<span><b>DNA</b> </span> 和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。</font>

<font>（二）材料与试剂</font>

<font><span>1</span> <span>．采用<span>Boehringer Mannheim</span> 公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗</span></font>

<font>体。</font>

<font><span>2</span> <span>．过氧化物酶（<span>-POD</span> ）标记的小鼠抗<span><b>DNA</b> </span> 单克隆抗体</span></font>

<font><span>3</span> <span>．链霉亲合素包被的微孔板</span></font>

<font><span>4</span> <span>．<span><b>DNA</b> </span> －组蛋白复合物，作为阴性对照。</span></font>

<font><span>5</span> <span>．<span>ABTS</span> 底物</span></font>

<font><span>6</span> <span>．溶解缓冲液</span></font>

<font><span>7</span> <span>．温育缓冲液</span></font>

<font><span>8</span> <span>．底物缓冲液</span></font>

<font>（三）样品</font>

<font><span>1</span> <span>．培养细胞或离体细胞的裂解物<span><span> </span> </span> 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用<span>200µl</span> 溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用<span>30min</span> 。</span></font>

<font><font><span>2</span> <span>．培养细胞的上清液</span></font></font>

<font><font><span>3</span> <span>．血浆（血清）</span></font></font>

<font><b><span><font>（四）操作方法</font></span></b></font>

<font><font><span>1</span> <span>．取样品离心后（<span>1 000r/min,10min</span> ）<span>,</span> 吸取<span>20µl</span> 上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。</span></font></font>

<font><font><span>2</span> <span>．另加入<span>80µl</span> 免疫反应试剂<span><span> </span> </span> 含抗－<span><b>DNA</b> </span> －<span>POD</span> 、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按<span>1</span> �<span>1</span> �<span>18</span> 混合），室温下孵育<span>2h</span> （置摇床上，<span>250r/min</span> ）。</span></font></font>

<font><font><span><font>3</font> </span> <span>．取上清</span> <span>，用<span>300µl</span> 温育缓冲液洗涤<span>3</span> 次，小心移去洗涤液。</span></font></font>

<font><font><span>4</span> <span>．加入<span>100µl</span> 底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。</span></font></font>

<font><font><span>5</span> <span>．尽快作比色分析（<span>10min</span> ～<span>20min</span> 内），用底物缓冲液作空白对照，以波长<span>405nm</span> ，参考波长<span>492nm</span> 进行检测。</span></font></font>

<font><font><b><span>（五）结果判定</span> </b> <span><span> </span> </span></font></font>

<font><span><font><font>按下列公式计算细胞释放的单<span>/</span> 低聚核小体片段的特别聚集值：</font> </font> </span> </font>

<font><font><span>注：</span> <span><font>mU=</font> </span> <span>吸收值（</span> <span><font>10^-3 </font> </span> <span>）</span> <span><font>=</font> </span> <span>双孔吸收值的平均</span> <span><font>OD</font> </span> <span>值－底物</span> <span><font>OD</font> </span> <span>值，若样品的吸</span> <span>收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。</span> </font> </font>

<font> </font>

<font><font><span><span><font><strong>细胞凋亡相关产品及资料</strong> </font> </span> </span> </font> </font>

• <font><font>肿瘤抑制/细胞凋亡相关抗体</font> </font>
• <font><font>特异性siRNA库-细胞凋亡类</font> </font>
• <font><font>细胞凋亡检测试剂</font> </font>
• <font><font>细胞增殖检测试剂</font> </font>
• <font><font>流式细胞检测</font> </font>
• <font><font>荧光染料和淬灭剂</font> </font>
• <font><font>活性染料和化合物</font> </font>
• <font><font>激光共聚焦显微镜</font> </font>
• <font><font>电子显微镜</font> </font>
• <font><font>组织染色</font> </font>

<font><strong>ELISA相关仪器试剂设备</strong> </font>

• <font><font>酶标仪</font> </font>
• <font><font>洗板机</font> </font>
• <font><font>化学发光检测仪</font> </font>
• <font><font>ELISA检测试剂盒</font> </font>
• <font><font>ELISPOT检测</font> </font>
• <font><font>ELISA试剂盒</font> </font>
• <font><font>抗体</font> </font>
• <font><font>酶标板</font> </font>