ELISA法检测细胞凋亡

 

（一） 原理

 

细胞凋亡的发生，是由于钙- 镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA , 产生180bp ～200bp 或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A 、H2B 、H3 和H4 形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA 和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。

 

（二）材料与试剂

 

1 ．采用Boehringer Mannheim 公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗

 

体。

 

2 ．过氧化物酶（-POD ）标记的小鼠抗DNA 单克隆抗体

 

3 ．链霉亲合素包被的微孔板

 

4 ．DNA －组蛋白复合物，作为阴性对照。

 

5 ．ABTS 底物

 

6 ．溶解缓冲液

 

7 ．温育缓冲液

 

8 ．底物缓冲液

 

（三）样品

 

1 ．培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200µl 溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min 。

 

 

2 ．培养细胞的上清液

 

3 ．血浆（血清）

 

（四）操作方法

 

1 ．取样品离心后（1 000r/min,10min ）, 吸取20µl 上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。

 

2 ．另加入80µl 免疫反应试剂 含抗－DNA －POD 、抗组蛋白－生物素及温育缓冲液（按1 �1 �18 混合），室温下孵育2h （置摇床上，250r/min ）。

 

3 ．取上清 ，用300µl 温育缓冲液洗涤3 次，小心移去洗涤液。

 

4 ．加入100µl 底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。

 

5 ．尽快作比色分析（10min ～20min 内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm ，参考波长492nm 进行检测。

 

（五）结果判定

 

按下列公式计算细胞释放的单/ 低聚核小体片段的特别聚集值：

注： mU= 吸收值（ 10^-3 ） = 双孔吸收值的平均 OD 值－底物 OD 值，若样品的吸 收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。

 

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