Annexin法检测细胞凋亡
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法检测细胞凋亡基本与Annexin-V-FLUOS和PI双标记法相同,早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于细胞膜外,PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的连接素V(Annexin V),但细胞仍然保持其细胞膜的完整性,使荧光染料PI不能进入细胞(因为PI只能进入已经破损的细胞膜);然而,坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞可同时被Annexin与PI标记,用FCM可定量分析受标记的凋亡与坏死的细胞数(见表)。
用Annexin法检测坏死细胞和凋亡细胞的特点
正常细胞
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凋亡细胞
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坏死细胞
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Annexin-V 染色
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-
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+
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+
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PI 染色
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-
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-
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+
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[材料与试剂]
(1)Annexin V-FITC :20mg/ml
(2)结合缓冲液: 10mmol/L Hepes/NaOH,pH 7.4,140mmol/L NaCl,2.5mmol/L CaCl2 。
[操作步骤]
(1)将培养细胞以0.1mmol/L PBS 液(pH 7.4)洗两次,溶于190ml结合缓冲液中,调整细胞浓度为1x106 /ml;
(2)加10ml 20mg/L的PI,混匀,避光室温作用10分钟;
(3)用结合缓冲液洗1次后用流式细胞仪进行分析;
[结果分析]
正常活细胞为Annexin- /PI- ,凋亡细胞为Annexin+ /PI- ,继发性怀死细胞为Annexin+ /PI+ ,而机械性损伤细胞为Annexin- /PI+ 。