简介
Annexin V/PI 双染法可以用于分析活细胞、凋亡细胞及坏死细胞。
由于正常细胞不被染色，凋亡细胞可被标记上 Annexin V，坏死细胞和凋亡晚期细胞可被 PI 染色，因此利用流式细胞术可以将各群细胞明显地区分开来。
材料与仪器
器材：CO2 培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、离心机及流式细胞仪。
试剂：
① 含 10％ FBS 的 RPMI 1640 培养液。
② 地塞米松磷酸钠注射液。
③ PBS（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl， 4.3 mmol/L Na2 HPO4•7 H20，1.4 mmol/L KH2PO4）。
④ Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒。
步骤
Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步，本方法以检测地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡为例介绍 Annexin V/PI 双染法：
A. 胸腺细胞经 2μmol/L 地塞米松处理，37℃、5％ CO2 细胞培养箱培养 10 小时。阴性对照组为细胞培养液中不加地塞米松。
B. 依次收集每孔细胞悬液，用结合液洗 2 次，于 4℃ 800 g 离心 5 分钟，最后加结合液 100μl 重新悬浮细胞。
C. Annexin -FITC 溶液和 PI 溶液各加 5μl，混匀后 4℃ 避光孵育 15 分钟。
D. 加入 400μl 结合液，重新悬浮细胞后，以流式细胞仪检测细胞凋亡情况，每个样品检测 10 000 个细胞，用 Cellquest 软件进行细胞凋亡分析。
注意事项
1. 洗涤细胞一定要用含钙离子的结合液，否则 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸不结合。如果试剂盒提供的结合液不够用，可用含钙离子的其他平衡缓冲液代替。
2. FITC 特别容易淬灭，标记时注意避光，观察时动作要迅速。染色后应立即上机检测，1 小时内检测完毕。
3. 不同公司的 Annecxin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒操作步骤略有不同，应按照操作说明进行。
4. 严格细胞计数，细胞过多会影响染色和检测结果。
5. PI 具有毒性，有潜在的致畸作用，操作时要戴乳胶手套，注意防护。
6. 实验应设立阴性和单阳性对照，以调整样品检测的最佳工作电压和荧光补偿，优化检测条件。
7. 细胞凋亡检测也可以不加 PI 利用 Annexin-FITC 进行单染，不需要作单阳性对照，直接做直方图分析凋亡率，易操作，方便。
8. 被标记的细胞除可以用于流式细胞仪检测外，还可以用荧光显微镜进行观察分析细胞凋亡，计算细胞凋亡指数。
来源：丁香实验
