Annexin V-PI双染法

Annexin V-PI 双染法

在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。在流式细胞 仪的结果中可见AnnexinV-FITO+)、PI”’细胞为凋亡细胞，而AnnexinV-FITC(+) 、PI(+) 为坏死细胞。

AnnexinV-FITC-PI检测凋亡的商品化试剂盒的发展很成熟，标记的过程相当简单，效果也很好。试剂盒中一般包括标记好的AnnexinV-FITC、配好的PI染液(10mg／m1)和标记缓冲液(10X 0．1 mol／L Hepes／NaOH，pH7．4，1．4 mol／L NaCl，25 mmol／LCaCl2，使用前用去离子水稀释至1X工作液)。

(1)常规收集细胞，以冷的PBS洗两次，以lX标记缓冲液重悬细胞至lXl06 细胞/ml

(2)吸取100／ll细胞(1X10‘)进行标记，加入5ul AnnexinV-FITC和5ul PI。

(3)将细胞混匀，在室温下避光孵育15rain左右。

(4)每管中另加400／A1标记缓冲液，在1h内上样。