TUNEL 法检测细胞凋亡

TUNEL 法习惯称为末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法（erminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling,TUNEL)。

TUNEL 法比 DNA 缺口翻译标记法灵敏 10 倍以上。使用 TUNEL 系统具有很低的非特异性染色，凋亡细胞产生的信号强度至少比非凋亡细胞高 40 倍，测定凋亡细胞的灵敏度较测定死亡细胞高 10 倍。

TUNEL 法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步，本方法以分析 TRAIL 作用的 U937 细胞的凋亡情况为例：

（一）细胞处理与固定

A 收集培养的 U937 细胞，调细胞密度为 2x10⁶/ml，备用。

B 实验分组：凋亡组，于 24 孔培养板每孔加 1 ml 细胞悬液，加 TRAIL 使其终浓度为 200ng/ml，总体积 1.5 ml。细胞置 CO2 培养箱中培养 4 小时。阴性对照组，不加 TRAIL。

C 收集每孔的细胞悬液，离心洗涤后将细胞悬浮于 0.5 ml PBS 中，用 4% 多聚甲醛固定，混合均匀，置冰上固定 30 分钟。

D 于 4℃800 g 离心 6 分钟，弃尽上清，沉淀悬浮于 5 mlPBS 中，重复离心一次，弃上清。

E 将细胞悬浮于 70% 的冷乙醇中至少固定 30 分钟。可将细胞悬浮于 3 ml70% 的冷乙醇中，于-20℃ 保存几天，备用。

（二）细胞染色

A 1 ml 细胞悬液于 4℃ 800 g 离心 10 分钟，弃上清，沉淀悬浮于 5 ml PBS 中，重复离心 1 次，弃上清。细胞重新悬浮于 1 mlPBS，移入 2.0 ml 的微量离心管中，离心后弃尽上清。

B 每管加 1 ml 试剂盒中的细胞洗涤液（washing buffer），以 800 g 离心 6 分钟，洗涤 2 次。

D 于 37℃ 避光标记 60 分钟，每 15 分钟摇动 1 次。

E 1 ml 的细胞洗涤液（rinse buffer）（红帽），离心去上清，重复 1 次。

G 加入 0.5 ml PI/RNA 酶染色液，于室温避光染色 30 分钟。样品上流式细胞仪检测。

1．洗涤细胞一定要用含钙离子的结合液，否则 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸不结合。如果试剂盒提供的结合液不够用，可用含钙离子的其他平衡缓冲液代替。

2．FITC 特别容易淬灭，标记时注意避光，观察时动作要迅速。染色后应立即上机检测，1 小时内检测完毕。

3．不同公司的 Annecxin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒操作步骤略有不同，应按照操作说明进行。

4．严格细胞计数，细胞过多会影响染色和检测结果。

5．PI 具有毒性，有潜在的致畸作用，操作时要戴乳胶手套，注意防护。

6．实验应设立阴性和单阳性对照，以调整样品检测的最佳工作电压和荧光补偿，优化检测条件。

7．细胞凋亡检测也可以不加 PI 利用 Annexin-FITC 进行单染，不需要作单阳性对照，直接做直方图分析凋亡率，易操作，方便。