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TUNEL 法检测细胞凋亡

相关实验:基于流式细胞术检测细胞凋亡

最新修订时间:

简介

TUNEL 法习惯称为末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(erminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labelling,TUNEL)。


TUNEL 法比 DNA 缺口翻译标记法灵敏 10 倍以上。使用 TUNEL 系统具有很低的非特异性染色,凋亡细胞产生的信号强度至少比非凋亡细胞高 40 倍,测定凋亡细胞的灵敏度较测定死亡细胞高 10 倍。

材料与仪器

器材:CO2 培养箱,生物安全柜,倒置显微镜,离心机及流式细胞仪。
试剂:
① 含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养液
② rhTRAIL
③ PBS (137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 4.3 mmol/L Na2HPO4•7H20, 1.4 mmol/L KH2PO4)
④ APO-BrdU 细胞凋亡检测试剂盒
⑤ 固定剂,含 1% 多聚甲醛的 PBS,pH7.4 和预冷的 70% 乙醇


步骤

TUNEL 法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步,本方法以分析 TRAIL 作用的 U937 细胞的凋亡情况为例:


(一)细胞处理与固定


A 收集培养的 U937 细胞,调细胞密度为 2x106/ml,备用。


B 实验分组:凋亡组,于 24 孔培养板每孔加 1 ml 细胞悬液,加 TRAIL 使其终浓度为 200ng/ml,总体积 1.5 ml。细胞置 CO2 培养箱中培养 4 小时。阴性对照组,不加 TRAIL。


C 收集每孔的细胞悬液,离心洗涤后将细胞悬浮于 0.5 ml PBS 中,用 4% 多聚甲醛固定,混合均匀,置冰上固定 30 分钟。


D 于 4℃800 g 离心 6 分钟,弃尽上清,沉淀悬浮于 5 mlPBS 中,重复离心一次,弃上清。


E 将细胞悬浮于 70% 的冷乙醇中至少固定 30 分钟。可将细胞悬浮于 3 ml70% 的冷乙醇中,于-20℃ 保存几天,备用。


(二)细胞染色


A 1 ml 细胞悬液于 4℃ 800 g 离心 10 分钟,弃上清,沉淀悬浮于 5 ml PBS 中,重复离心 1 次,弃上清。细胞重新悬浮于 1 mlPBS,移入 2.0 ml 的微量离心管中,离心后弃尽上清。


B 每管加 1 ml 试剂盒中的细胞洗涤液(washing buffer),以 800 g 离心 6 分钟,洗涤 2 次。


C 将细胞悬浮于 50μl DNA 标记反应液,反应液配制见表 19 - 1。

D 于 37℃ 避光标记 60 分钟,每 15 分钟摇动 1 次。


E 1 ml 的细胞洗涤液(rinse buffer)(红帽),离心去上清,重复 1 次。


F 将细胞悬浮于 100μl 抗体染色液中,抗体染色液配制见表 19 - 2。于室温避光反应结合 30 分钟。


G 加入 0.5 ml PI/RNA 酶染色液,于室温避光染色 30 分钟。样品上流式细胞仪检测。


H 用单阳性细胞对流式细胞仪检测条件进行优化。



注意事项

1.洗涤细胞一定要用含钙离子的结合液,否则 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸不结合。如果试剂盒提供的结合液不够用,可用含钙离子的其他平衡缓冲液代替。


2.FITC 特别容易淬灭,标记时注意避光,观察时动作要迅速。染色后应立即上机检测,1 小时内检测完毕。


3.不同公司的 Annecxin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒操作步骤略有不同,应按照操作说明进行。


4.严格细胞计数,细胞过多会影响染色和检测结果。


5.PI 具有毒性,有潜在的致畸作用,操作时要戴乳胶手套,注意防护。


6.实验应设立阴性和单阳性对照,以调整样品检测的最佳工作电压和荧光补偿,优化检测条件。


7.细胞凋亡检测也可以不加 PI 利用 Annexin-FITC 进行单染,不需要作单阳性对照,直接做直方图分析凋亡率,易操作,方便。


8.被标记的细胞除可以用于流式细胞仪检测外,还可以用荧光显微镜进行观察分析细胞凋亡,计算细胞凋亡指数。


来源:丁香实验

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