简介
亚二倍体分析法是利用亚二倍体 DNA 染料与 DNA 结合，检测细胞内 DNA 含量的变化，常用的染料是碘化丙啶（propidium iodide，PI）。
材料与仪器
器材：CO2 培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、离心机及流式细胞仪。
试剂：
① 含 10％FBS 的 RPMI 1640 培养液。
② 人交联重组可溶性 FasL（rhFasL）。
③PI 染色液 PI 0.5 mg、RNase 0.2 mg、1.0％Triton- 100、生理盐水 6.5 ml、枸橼酸钠 10 mg、加蒸馏水至 95 ml，调 pH 至 7.4，定容为 100 ml，放于棕色瓶中，4℃、避光保存。
④ 70％ 预冷乙醇
步骤
亚二倍体分析法检测细胞凋亡的基本过程可分为如下几步，本方法以检测 FasL 诱导细胞凋亡为例介绍亚二倍体分析法：
A. 实验分组凋亡组，收集细胞，调细胞密度为 1x106／ml。
于 6 孔板中加 HL60 细胞液 2 ml，加 rFasL 溶液至终浓度为 300ng／ml，补加含 10％FBS 的 RPMI 1640 培养液至总体积为 3 ml，
于 37℃、5％ CO2 培养作用 4 小时；阴性对照组，含 10％FBS 的 RPMI 1640 培养液培养细胞。
B. 在倒置显微镜下观察细胞凋亡情况。然后，依次收集每孔细胞悬液，加入 5 ml PBS，于 4℃ 900 g 离心 8 分钟，弃上清。
C. 加入 5 ml 预冷的 70％ 无水乙醇，于 4℃ 固定至少 4 小时，并间断性摇动。于 4℃ 以 1000 g 离心 8 分钟，弃上清。用 PBS 以 1000 g 离心 8 分钟，洗 2 次，弃上清。
D. 加入 0.5 ml PI 染色液，于室温避光孵育 30 分钟。移入流式管内备用。
E. 流式细胞仪检测 通过 FSC／SSC 散点图收集 10,000 个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和细胞碎片，分析 PI 荧光直方图上细胞周期的百分率及凋亡细胞百分率。
注意事项
1. 细胞必须固定，固定用预冷的 60％-80％ 乙醇，于 4℃ 至少固定 4 小时。固定细胞在低温可长期存放。
2. 固定的细胞必须充分洗涤以使小分子 DNA 片段渗透出来。
3. 固定的细胞必须用 RNA 酶进行处理以消除细胞内 RNA 对测定结果的影响。RNA 酶必须经高温预处理灭活 DNA 酶等。
4. 染色必须避光。
5. 严格细胞计数，细胞过多会影响染色和检测结果。
6. PI 具有毒性，有潜在的致畸作用，操作时要。
7. 设立正常对照，通常以正常人外周血白细胞作标准参照，确保倍体计算的准确性。
来源：丁香实验
