线粒体膜电位检测法检测细胞凋亡

器材：培养箱，生物安全柜，荧光显微镜，离心机，流式细胞仪，移液枪，枪头，15 ml 离心管。

试剂：含 10％ FBS 的细胞培养基，PBS，线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1），灭菌超纯水

1. JC-1 染色工作液的配制，按照试剂盒说明配制相应用量的 JC-1 染色工作液。

2. 设置阳性对照，阳性对照为 CCCP， 按照 10 μM 的终浓度 37 ℃ 处理细胞 20 分钟。

3. 若用流式仪检测，则收集细胞，悬浮细胞直接收集，贴壁细胞消化后收集，细胞 1 000 rpm 离心后 3 分钟，去上清液，用 0.5 ml 细胞培养液重悬

4. 加入 0.5 ml JC-1 染色工作液，混匀后置 CO₂ 培养箱继续孵育 20 分钟。

5. 以 600 g，4 ℃ 离心 3 分钟，用移液器小心移去上清。用 JC-1 染色缓冲液洗 2 次，以 600 g，4 ℃ 离心，每次 3 分钟。

6. 弃上清，每管加 500 μl JC-1 染色缓冲液重悬细胞。

7. 以流式细胞仪检测细胞，每个样品检测，10 000 个细胞，获取检测数据并分析。

8. 若用荧光显微镜拍照检测，则不用收集细胞，需检测的细胞去除培养基，PBS 洗涤 1 次。

9. 加入 1 ml JC-1 染色液，细胞培养箱中孵育 20 分钟。

10. 去除上清，用 JC-1 染色缓冲液洗涤 2 次。

11. 加入 1 ml 细胞培养基，荧光显微镜下观察拍照。

1. 工作液配制先把 JC-1（200x）用超纯水充分溶解混匀后，加入 JC-1 染色缓冲液（5x）。不可先配制 JC-1 染色缓冲液（1x）再加入 JC-1（200x），这样 JC-1 会很难充分溶解，会严重影响后续的检测。

 

2. 装载完 JC-1 后用 JC-1 染色缓冲液（1x）洗涤时，使 JC-1 染色缓冲液（1x）保持 4℃ 左右，此时的洗涤效果较好。

 

3. JC-1 探针装载完并洗涤后尽量在 30 分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

 

4. 请勿把 JC-1 染色缓冲液（5x）全部配制成 JC-1 染色缓冲液（1x），试剂盒使用过程中需直接使用 JC-1 染色缓冲液（5x）。

 

5. 如果发现 JC-1 染色缓冲液（5x）中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在 37 ℃ 加热。

 

6. 为达到理想的检测结果应设立阳性对照和阴性对照。以阳性对照进行荧光补偿及条件优化。

 

7. 一般用 CCCP 处理细胞作为阳性对照。CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

 

8. 不同公司的试剂盒操作步骤略有不同，应严格按照说明书进行操作。