TUNEL法检测细胞凋亡操作步骤

操作步骤（Roche公司）

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min；

3.PBS漂洗2次；

4.用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min；

5.PBS漂洗2次；

6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。

7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。

8.PBS漂洗3次；

9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm）

10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

11.PBS漂洗3次；

12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min；

13.PBS漂洗3次；

14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数（200～500个细胞）并拍照。

操作步骤（Promega公司）

1. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次；

2. 水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）

3. 浸洗：0.85％NaCl×5 min→PBS洗5 min；

4. 固定：浸入4％多聚甲醛15 min；

5. 浸洗：PBS 5 min×2次；

6. 细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT；

7. 浸洗：PBS洗5 min；

8. 固定: 浸入4％多聚甲醛5 min；

9. 浸洗：PBS 5 min×2次；

10. 平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5～10） min；

11. 制备TUNEL反应混合液：处理组用1 μl rTdT＋1 μl 生物素标记的dUTP＋98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。

12. 标记反应：加100 μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。

13. 终止反应：浸入2×SSC 15 min；

14. 浸洗：PBS 5 min×3次；

15. 封闭POD：浸入0.3％H2O2 15 min；

16. 浸洗：PBS 5 min×3次；

17. 酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1:500 PBS稀释）30 min；

18. 浸洗：PBS 5 min×3次；

19. DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液＋50 ul H2O220×＋950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。

20. 用去离子水冲洗几次；

21. 用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。