Annexin-V-FLUOS和PI双标记法检测细胞凋亡
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Annexin-V-FLUOS 和PI双标记法检测细胞凋亡
凋亡早期，细胞表面可发生改变，细胞膜的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内转移到胞膜外层，从而使PS暴露在细胞表面。在凋亡发生时，巨噬细胞能特异性识别暴露在细胞表面的PS，从而吞噬凋亡细胞和凋亡小体，使机体免于细胞内容物释出所引起的炎症反应和伴有的组织细胞坏死。Annexin-V 是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力。因此该蛋白可以作为一种敏感的探针，用以检测暴露在细胞膜外层的 PS，故适合凋亡细胞的检测。由于坏死细胞失去膜的完整性，PS也会暴露，故必须区分凋亡细胞与坏死细胞。用一种PI染料做染色排斥实验，就可以从Annexin-V染色阳性细胞群中区分出坏死的细胞。在荧光显微镜下观察，正常细胞无任何荧光标记；凋亡细胞膜上染有黄绿色光环；坏死细胞膜上染有黄绿色光环，胞核被PI染成红色。
【材料与试剂】
（1）Annexin-V-FLUOS Staining Kit（ 宝灵曼公司产品）：
Annexin-V-Fluorescein （瓶1）
Propidium iodide （瓶2）
Binding Buffer （瓶3）
标记液的配制（用于10份试验）：将20μl Annexin-V-Fluorescein（瓶1）溶于1000μl Binding Buffer（瓶3），然后加20μl PI（瓶2）。
（2）培养细胞或离体细胞制成的单个细胞悬液
（3）荧光显微镜
（4）PBS
【操作方法】
收集细胞，用PBS洗涤两次，4000r/min离心2min，吸弃上清；；
细胞团块重悬在100μl标记液中，室温孵育10～15min，PBS洗二次；
荧光显微镜下观察；
【结果判断】
正常细胞无任何荧光标记；凋亡细胞膜上染有黄绿色光环；坏死细胞膜上染有黄绿色光环，胞核被PI染成红色。
