流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V/PI 双染色法）

流式细胞术目前主要用于检测样本中所发出的荧光强度，分析细胞表面和细胞内分子表达水平，从多样性的细胞群中分辨及界定不同细胞种类，测定分离出的细胞亚群纯度，以及分析细胞的大小和总量。它可以同时分析单个细胞的多个参数。

1、精确反应细胞群体的凋亡趋势；

2、对细胞中凋亡细胞进行分群和定量；

3、对凋亡细胞进行分群和定量

1、孵育缓冲液：10 mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl₂

2、标记液：将 FITC- Annexin V 和 PI 加入到孵育缓冲液中，终浓度均为 1 ug/ml

3、流式细胞仪

1、细胞收集：悬浮或贴壁细胞（无 EDTA 胰酶消化）收集到离心管中，300-500 g 离心 5 min，弃去培养液；

2、用 PBS 洗涤细胞两次，300-400 g，2-8℃，离心 5 min 收集细胞；

3、按不同试剂公司说明取相应量的荧光染料标记结合溶液重悬细胞，浓度大约为（1~5）×10⁶/mL；

4、按不同试剂公司说明向 100 μL 细胞混悬液中加入适量的荧光标记的 Annexin V 染料，轻轻混匀后室温或 2-8℃ 避光条件下孵育 5-15 min；

5、按不同试剂公司说明加入适量的核酸染料，轻轻混匀后室温或 2-8℃ 避光条件下孵育 1-5 min；

6、加入 400μL PBS，轻轻混匀；

7、细胞过 200 目筛网后流式细胞仪检测；

结果说明：

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(-) PI/7-AAD(-)——活细胞；

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(+) PI/7-AAD(-)——早期凋亡细胞;

FITC-Annexin V/PE-Annexin V(+) PI/7-AAD(+)——中晚期凋亡细胞。

1、细胞处理要小心，尽量减少人为损伤，离心力在不损失细胞的情况下尽可能小，重悬细胞要小心，避免多次吹打，不要涡旋；

2、荧光染料操作时要低温、避光；

3、含血小板的血液样品要去除血小板，因血小板含 PS，可与 Annexin V 结合干扰实验结果；

4、流式细胞检测细胞量不得小于1×10^⁵；

5、染色完成后过筛的单细胞悬液要尽快上机检测，缓冲液中细胞存活时间不常；

6、 注意设置对照：空白对照、单染对照、阳性对照。

1、实验中的诱导剂是否能产生凋亡，解决办法-确切的凋亡诱导剂设置阳性对照；

2、贴壁细胞消化不当，解决办法-无 EDTA 胰酶消化，Annexin V 与 PS 的结合依靠二价钙离子，EDTA 可螯合钙离子影响结合进而影响染色。