直接标记法

直接标记法

当使用多种荧光抗体标记细胞时，直接标记的荧光抗体可以同时加入，而不必按顺序加人。下面的实验实例显示的是用三种荧光抗体同时标记 T 淋巴细胞亚群，这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行使用浓度滴定。

实验材料

白细胞悬液（确定的细胞数量并经梯度纯化过）

anti-CD3 藻红蛋白（PE)

anti-CD8 荧光素（FITC)

anti-CD4 CyChrome(Cy5)

与特异性抗体蛋白浓度一致的 P E 、F IT C 、Cy5 标记的同型对照

PBS，p H 7.2,  4℃平衡

洗涤缓冲液（PBS+0. 1 % 叠 氮 钠 + 1 % 胎 牛 血 清 或 BSA) ，0. 22μm 滤 膜 过 滤 ，4℃平衡

甲酵 [Polysciences，Warrington，PA ;cat.No.18814, 不含甲醇，16(质量分数）]

时间
60〜90 min。

特殊仪器

离心机

细胞计数装置

微量移液器（ 移液体积精确到 10〜200W 和 1000mI)

流式细胞仪

步骤

(1) 收获或分离细胞，用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液，调整细胞浓度至 5X10⁵细胞/ml。

(2) 在 每 个 12 mmX 75 mm 管 加 人 Im l 细胞悬液以用于以下染色：每种抗体（一抗和同型对照）的单染；三种抗体的同时染色；一管不加抗体的阴性对照。

(3) 1500 g离心 3 min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液 体 (约 100ul)。

(4) 按预先滴定量在每管中加人荧光标记的抗体或对照血清或同型对照。

(5) 振汤混勾，冰上避光放置 15 min。

(6) 加 人 Im l 冰冷 的 PBS。振荡混匀。

(7) 1500g离心 3 min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。

(8) 加 入 0.5 ml PBS 并振荡混匀。

(9) 加 人 0.5m l 甲醛固定液（2% ，体积分数）。避光保存于 4℃ 直到实验分析结束。

(10) 流式细胞仪每个样本检测 10000个门内细胞。

结果

图 13. 6 中流式细胞数据以双参数直方图的形式表示，1 轴和 3；轴分别表示两个不同的激发光，2；轴表示细胞数量，用量化的点密度来描述。每个样本通 S f i t c 对 照 PE、 PE对 照 CyChrome 和 FITC 对 照 CyChrome 来分析。单色标记的样本用来确定荧光存在于预期细胞群，并能调整存在于其他色轴此颜色信号的电子补偿。同型对照或未标记样本
直方图中的资料能用来获得阴性和阳性分析门，这 样 99% 的 阴 性 细 胞 落 在 阴 性 门 中 ，<1% 的细胞落在阳性门中。注 意 与 x 轴 和 3；轴交叉的两条线，它们划分出了落在每个象限的细胞数量。最下面的三幅图显示了只表达三种抗原表位中的一种的细胞（左上象限或右下象限）和表达其中两种抗原表位的细胞（右上象限）