间接标记法

间接标记法

下面的实验实例显示的是用两种得到荧光抗体间接标记 T 淋巴细胞亚群，这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行滴定 。 一 抗都是鼠单克隆抗体，每种抗体同种型不同，从而能够选择标记有不同荧光染料的大鼠抗小鼠同种型的二抗进行标记。此方法可使用未标记的同种型抗体作为阴性对照。间接标记法可用于特定动物多克隆抗血清的染色。例如，羊源的特异性一抗可以用荧光染料 1 标记的抗羊的二抗进行染色，而兔源的特异性一抗可以用荧光染料 2 标记的抗兔二抗进行染色。
可以想象，用这种方法多色标记细胞时，每加入额外的或不同种属特异性一抗时，实验都会变得更复杂。另外还要考虑抗某种属特异性的多克隆抗体要通过其他物种抗体的吸附 ，以排除因抗体交叉反应而非特异地标记其他动物来源抗体的机会。

实验材料

此部分列出的抗体都能从 Southern Biotech(Birmingham，AL) 公司获得。每种抗体都有推荐的工作液浓度。标记的二抗使用浓度一般为 1ug/10⁶ 细胞。淋巴细胞悬液（细胞计数，经梯度离心纯化）

anti-CD3 I g G l 鼠单克隆抗体

anti-CD8 IgG2a 鼠单克隆抗体

鼠 Ig G l 和 IgG2a 同型抗体

P E 标记的兔抗鼠 Ig G l 亲和纯化抗体
FITC 标记的兔抗鼠 IgG2a 亲和纯化抗体

PBS，pH7.2,4℃ 平衡

漂洗缓冲液（PBS + 0. 叠 氮 钠 + 1 % 胎 牛 血 清 或 BSA) ,0.22um 滤 膜 过 滤 ，4℃平衡

甲醛 [Polysciences，Warrington，P A ;cat.No.18814, 不含甲醇，16 % (质量分数）

时间

90 〜 120 mino

特殊设备

离心机

细胞计数设备

微量移液器 (移液体积精确到 10 〜200ul和 1000uI)

流式细胞仪

步骤

(1) 收获或分离细胞，用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液，调整细胞浓度至 5 X 10⁵细胞/ml。

(2) 在为每种抗体（未标记的一抗和同型对照）准 备 的 12m m X75m m 管 中 加 人 Iml细胞悬液，另备两只管，分别装所有抗体和只加二抗对照。

(3) 1500 g 离 心 3m in。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀可以残留少量液体（约 100ul)。

(4) 加人预先滴定过的适量抗体 (一抗或同型对照）。

(5) 混句，冰上避光放置 15min。

(6) 加 人 I m l 冰冷的清洗缓冲液。震荡混匀。

(7)1500 g 离心 3m in。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液体（约 IOOuI)。

(8) 按厂家推荐的使用浓度在每管加入二抗。

(9) 振荡混勾，冰上避光放置 15m in。

(10) 加 入 Im l PBS。振荡混匀。

(11) 1500 g 离 心 3m in。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。

(12) 加 人 0.5 ml PBS 并振荡混勻。

(13) 加 人 0.5m l 甲醛固定液（2 % ，体积分数）。实验分析结束前将样本避光保存于 4℃

(14) 用流式细胞仪分析每个样本，检测 1 0000个门内细胞。

结果

预期结果应与图 13. 6 中 H T C 与 P E 组合图形相似，其更大的优点在于信噪比较好，阴性细胞落于更左下的象限，阳性细胞位于其他三个象限。这是由于多个荧光标记的二抗能与结合同一未标记的一抗，从而具有潜在的信号放大效应。实验结果分析与前相同