间接ELISA法检测特异性抗体实验

一、实验材料：

1. 显色剂：碱性磷酸酶标记的蛋白A (Sigma公司），碱性磷酸酶标记的蛋白G (Calbiochem公司），碱性磷酸酶标记的抗球蛋白抗体
2. 抗原包被液
3. PBSN: PBS (附录 1)中含 0.05 % (m/V) NaN3
4. 水：去离子或蒸馏
5. 封闭缓冲液
6. 待检抗体标本溶液：用封闭缓冲液以I : 5 (WV)稀释的杂交瘤上清液（单元 1.4 ) 或腹水（单元1.4)或1 : 500 (WV)稀释的抗血清（单元1.2)，于锥底或圆底微量滴定板中配制（适量未免疫腹水或血清作阴性对照）；
7. MUP 或 NPP 底物溶液
8. 0.5mol/LNaOH (可选择的）
9. 多道移液管、一次性枪头
10. Immulon 2或 Immulon 4 (Dynatech公司）滴定板或其他等同的微量滴定板；
11. 塑料冲洗瓶
12. 微量滴定板读板仪（可选择的）：配有405nm滤光片的分光光度计、配有365nm 激发滤光片或450nm发射滤光片荧光分光光度计
13. 紫外灯，长波长（可选择的）；

二、实验方法

1. 十字交叉连续稀释分析法确定显色剂（酶标抗体）最适浓度（见辅助方案）。

   如要检测所有结合抗原的抗体，酶标抗体中抗体应含抗IgK和X轻链抗体。也可 用适宜的酶标蛋白A或酶标蛋白G筛选单克隆抗体。能与酶标蛋白A或酶标蛋白G 结合的特异单克隆抗体易于纯化和显示特性。

2. 十字交叉连续稀释分析法确定抗原包被液终浓度（见辅助方案）。用PBSN配制这种 终浓度抗原溶液（纯抗原溶液通常为 0.2 〜 10.O/ug/ml或 ≦ 2 ug/ml)。抗原应占全部蛋白质的 3% 以上，全部蛋白质浓度应小于10 ug/ml。每块板大约需 6 ml 抗原溶液。

   有些抗原在不同的 pH 下包被更有效率。

3. 使用多道移液管和枪头，在 Immulon 微量滴定板每孔中加入 50ul 抗原溶液，并将每个孔中的抗原溶液充分振荡混勻。用塑料盖封盖滴定板，室温下过夜孵育或 37°C 下孵育 2 h。如需要，可将封盖的滴定板在 4°C 下保存数月。

4. 弃去包被液，在水槽上方将洗瓶里或水龙头中去离子水或蒸馏水注入包被滴定板的 孔中，洗涤滴定板 2 遍以上。
5. 将洗瓶里的封闭缓冲液注入每个孔内，室温下孵育 30 min。用水洗涤滴定板 3 次，后于大张吸水纸上拍干去除残留液，倒扣在纸巾上。
6. 在每个包被过的孔内加入 50ul 用封闭缓冲液稀释的待测抗体标本溶液。实验中注意 重复利用沾染同样溶液的枪头，移液过程中用吸水纸去除枪头残留液。用封闭缓冲 液洗涤枪头 5 次，小心地将残留液弃至纸上。防止枪头中有气泡，如气泡去不掉则 更换枪头。用塑料盖封盖滴定板，室温下孵育 2 h 以上。
7. 用水洗涤滴定板 3 次。将封闭缓冲液注入每个孔中，振荡混匀，室温下孵育 10 min。 用水洗涤 3 次去除残留液。
8. 每孔中加入 50ul 含显色剂的封闭缓冲液（步骤 1 中选定的最适浓度）。用塑料封套包 裹，室温下孵育 2 h 以上。按步骤 7 洗涤滴定板。如需要，在加底物前滴定板可于 4°C 条件下保存数月。
9. 每孔中加入 75ul MUP或NPP底物溶液，室温下孵育 1h。目测观察定性显色反应， 或用微量滴定板读板仪定量检测（见下述）。之后观察显色反应以检测结合的低浓度 抗体（颜色深度与显色时间呈正比），加入 25ul 0.5mol/L NaOH 终止显色。

   (1) 目测出现黄色即发生NPP的显色反应。也可用配有405nm滤光片的微量滴定板 读板仪定量测定。
   (2)暗室内用长波长紫外灯照明，目测MUP的显色作用。也可用365nm激发滤光 片、450nm发射滤光片，以荧光分光光度计定量测定。