备选方案 2: 抗体夹心 ELISA 法检测可溶性抗原

一、附加材料（其他材料见基本方案）

特异性抗体（单克隆或多克隆）或者来自抗血清、腹水或杂交瘤上清液（单元1.4) 中的免疫球蛋白（单元 1.5，单元 1.7)。

二、实验方法

1. 用 PBSN 稀释特异性抗体或免疫球蛋白，配制包被抗体溶液（最终浓度 0.2〜10ug/ ml)。

2. 采用十字交叉连续稀释分析法，确定待检测抗原浓度所需的包被抗体和酶-抗体结合 物的浓度（见辅助方案），用 PBSN 配制此浓度的包被抗体溶液。

3. 用 50ul 包被抗体溶液包被 Immulon 滴定板，并封闭（见基本方案，步骤 3〜5)。

4. 用封闭缓冲液按 1:3 (WV) 连续稀释（见辅助方案）同源抗原，配制标准抗原的 系列稀释溶液。使用结合动态范围大（15%〜85%，总范围是 0.1〜1OOOng 抗原/ml) 的稀释液。

   虽然标准曲线对于精确测定待测样品中抗原量是必要的，但不需要用于定性检测。

5. 用封闭缓冲液配制待测抗原溶液的系列稀释度（通常是 1〜1OOng 抗原/ml)。如需 要，测定待测抗原溶液 1〜2 个系列稀释度，确保至少一个稀释度可以精确测定。

6. 抗体包被孔中加入待测抗原溶液或标准抗原稀释液（步骤 4)，室温下孵育 2 h 以上。做 2 或 3 个复孔确保可精确定性测量，快速加入样品以最大限度减少因孵育 时间不同造成的误差。

7. 洗涤滴定板（见基本方案，步骤 7)，加入 50ul 碱性磷酸酶标记的特异性抗体（通常是 25〜400ng 特异抗体/ml)，室温下孵育 2 h。

8. 洗涤滴定板，每孔中加人 75ul MUP 或 NPP 底物溶液，室温下孵育 1h，用微量滴定 板检测仪检测。如显色反应水平低，应在显色后数小时重新检测滴定板。
9. 绘制基于标准抗原溶液连续稀释数据的标准曲线。抗原浓度对数值为 X 轴，荧光度 或吸光度为^轴。用内插法，在标准曲线中求出待测溶液中抗原浓度。