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双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNF-α的含量

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实验试剂

1. 包被抗体McAb1 :使用时用包被液作适当稀释(如1:100)。

2. 酶标抗体McAb2 :以辣根过氧化物酶(HRP)标记。使用时用稀释液作适当稀释,其稀释度根据预试验结果而定。

3. rhuTNF-α标准品:已知含量的rhuTNF-(10ng/ml),使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度:5 ng/ml,2.5 ng/ml,1.25 ng/ml,625pg/ml,312 pg/ml,156 pg/ml,78 pg/ml。

4. PBS(0.01mol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液)

5. 包被液(0.05mol/L,pH9.6碳酶盐缓冲液)

6. 洗涤液(0.05%Tween-20-PBS)

7. 稀释液(含2% PEG的洗涤液或含10% BSA的PBS):稀释液主要用来酶标McAb2 和标准品rhaTNFα。2% PEG洗涤液的配制:2.9g Nacl,2.0g PEG(MW6000),0.6ml鸡蛋清溶于100ml PBS中。

8. 底物缓冲液(0.1mol/L,pH5.0的柠檬酸盐缓冲液):称取1.79g Na2 HPO4 ·12H2 O和1.29g柠檬酸,溶解至100ml双蒸水。

9. 底物液(显色液):将5mg ABTS或10mg OPD 溶于 10ml底物缓冲液中,加入20μl 3% H2 O2 (临用前配制)。

10. 终止液(2mol/L的H2 SO4 ):量取20ml 98% H2 SO4 ,缓缓加至80ml双蒸水中即可。

实验设备

1. 96孔酶标板(96孔ELISA板),酶标测定仪,495nm滤光片。

2. 其他:4℃冰箱,水浴箱,刻度吸管,毛细吸管,加样器(头)等。

实验材料

1. 待测样品:如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液等均可用于sTNF-α,后者应作适当稀释。

2. 阴性对照品:未免疫小鼠IgG。

实验步骤

1. 包被:将用包被液稀释好的McAb1 加入96孔酶标反应板,100μl /孔,置37℃温育2h后再移置4℃过夜(16-72h);

2. 洗涤:将96孔酶标板倾去包被液,用洗涤液加满各孔,置室温3min,然后倾去。反复洗涤3次。

3. 加样(均设双复孔)。

1) 将已知含量rHuTNF-α标准品用稀释液作倍比稀释后,分别加入1~7孔,100μl/孔,按浓度从低到高的顺序依次加样;

2) 8孔加入待测样品,100μl;

3) 9孔加阴性对照血清(未免疫小鼠IgG),100μl;

4) 10孔为空白对照(稀释液),100μl/孔;

4. 加样后,置37℃孵育1~2h。洗涤3次,方法同前;

5. 各孔加入HRP标记的McAb2 ,用稀释液作适当稀释,其稀释度根据预试验结果而定,100μl/孔;

6. 置37℃孵育1~2h;

7. 洗涤3次,方法同前;

8. 显色:各孔加新鲜配制的ABTS显色液(或OPD-H2 O2 显色液),100μl/孔,置室温或37℃下避光反应15-30min

9. 终止反应:各孔加入终止液2mol/L H2 SO4 ,50μl/孔;

10. 测定OD值:用酶标测定仪,以波长495nm测定各孔OD值。

注意事项

1. 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须经离心去除,匆用溶血或血脂过多的血清检测TNF-α含量。

2. 待测样品在2-8℃可放置3d,超过3d应放入-20℃或-70℃冰箱,且应避免反复冻融,宜分装保存。

3. TNF-α标准品的质量直接影响待测样品结果的准确性,应注意商品试剂盒中的标准品可随时间延长而效价降低。

4. 分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉使用。

5. 叠氮钠(NaN3 )对辣根过氧化物酶有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。­­

6. 底物显色液应在临用前配制,置4℃避光保存,H2 O2 应置2-8℃,保存6个月以内。加入底物显色15-30min后应立即测定OD值。

7. 应避免反应孔中有气泡,以免影响所测OD值的准确性。

8. 用不同来源的样品、不同实验室所测得的TNF-α含量不同,正常值标准也难于统一。可进行大样本测定,以X 2SD确定自己实验室各种来源检测样品的TNT-α正常值范围。一般ELISA法测定血清标本时,TNF-α参考值范围为4.3 2.8μg/L(或4.3 2.8ng/ml)。

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