双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNF-α的含量
互联网
实验试剂
1. 包被抗体McAb1 ：使用时用包被液作适当稀释(如1：100)。
2. 酶标抗体McAb2 ：以辣根过氧化物酶(HRP)标记。使用时用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。
4. PBS(0.01mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液)
8. 底物缓冲液(0.1mol/L，pH5.0的柠檬酸盐缓冲液)：称取1.79g Na2 HPO4 ·12H2 O和1.29g柠檬酸，溶解至100ml双蒸水。
9. 底物液(显色液)：将5mg ABTS或10mg OPD 溶于 10ml底物缓冲液中，加入20μl 3% H2 O2 (临用前配制)。
10. 终止液(2mol/L的H2 SO4 )：量取20ml 98% H2 SO4 ，缓缓加至80ml双蒸水中即可。
实验设备
1. 96孔酶标板(96孔ELISA板)，酶标测定仪，495nm滤光片。
2. 其他：4℃冰箱，水浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器(头)等。
实验材料
1. 待测样品：如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液等均可用于sTNF-α，后者应作适当稀释。
实验步骤
1. 包被：将用包被液稀释好的McAb1 加入96孔酶标反应板，100μl /孔，置37℃温育2h后再移置4℃过夜(16-72h)；
2. 洗涤：将96孔酶标板倾去包被液，用洗涤液加满各孔，置室温3min，然后倾去。反复洗涤3次。
1) 将已知含量rHuTNF-α标准品用稀释液作倍比稀释后，分别加入1～7孔，100μl/孔，按浓度从低到高的顺序依次加样；
5. 各孔加入HRP标记的McAb2 ，用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定，100μl/孔；
8. 显色：各孔加新鲜配制的ABTS显色液(或OPD-H2 O2 显色液)，100μl/孔，置室温或37℃下避光反应15-30min
9. 终止反应：各孔加入终止液2mol/L H2 SO4 ，50μl/孔；
10. 测定OD值：用酶标测定仪，以波长495nm测定各孔OD值。
注意事项
1. 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须经离心去除，匆用溶血或血脂过多的血清检测TNF-α含量。
2. 待测样品在2-8℃可放置3d，超过3d应放入-20℃或-70℃冰箱，且应避免反复冻融，宜分装保存。
3. TNF-α标准品的质量直接影响待测样品结果的准确性，应注意商品试剂盒中的标准品可随时间延长而效价降低。
5. 叠氮钠(NaN3 )对辣根过氧化物酶有灭活作用，在本实验系统中应避免使用。
6. 底物显色液应在临用前配制，置4℃避光保存，H2 O2 应置2-8℃，保存6个月以内。加入底物显色15-30min后应立即测定OD值。
