夹心 ELISA

「夹心」 ELISA

夹心法是免疫检测中最简单和最有用的方法之一，它可用于检测样品中抗原的浓度(图 14.1)。将一种抗体包被到酶标板中。当把包含靶抗原的溶液加入微孔中时，包被的抗体捕获抗原，仔细洗涤去除未结合抗原。二抗识别的是被一抗捕获在固相表间上的抗原的不同表位。洗涤去除过量的二抗。二抗通常被标记从而有助于进行定量检测。

「夹心」E L IS A 除了快速和简便的特点外，还具有精确性和可重复性，并且抗原不需要精制。

「夹心」E L IS A 的灵敏度依赖于多种因素，如捕获抗体是否有效地结合到酶标板上，抗体的亲和力及二抗的「特异性」
等 。

操作步骤

(1) 每孔中加人 50^1 抗体溶液（2 〇 pg/m l，溶 于 PBS) ，将捕获抗体包被在酶标板表面 。虽然每个实验都是不同的，但 每 孔 1 ug 抗体是很好的开始 。室 温 孵 育 1h或 4℃过夜。

(2) PBS 洗 板 2 次 。该步骤可用多道微量移液器或喷壶操作。

(3) 用封闭缓冲液封闭剩佘的蛋白结合位点。通常使用的封闭液是 3 % 小牛血清白蛋白或脱脂奶粉溶液 (溶于 PBS 或 TBS)。孵 育 l h

(4) PBS 洗 板 2 次

(5) 各孔中加人系列稀释的抗原溶液 50 jul。用封闭液（3 % 小牛血清白蛋白/pBS) 对抗原进行稀释。在湿润环境中，室温解育至少 2 h 。

(6) PBS 洗 板 4 次 。

(7) 加人标记的二抗。该抗体加入的总量应通过预实验来决定。为精确定量，二抗应该是过量的。用封闭液对二抗进行稀释。

(8) 在湿润环境中，室温孵育 2 h 或更长时间。

(9) PBS 洗板数次。

(10) 按厂商说明所述加人底物作为指示剂。在显色反应到达建议的孵育时间后，通过酶标仪在适合的光密度条件下进行读数。

为了得到定量的结果，未知样品的信号可与标准曲线进行比较。为了确保实验的精确性，每次实验中都应加入标准品。

操作注意事项

(1) 叠氮钠是过氧化物酶的抑制剂。如果使用 H R P 标记的抗体，缓冲液或漂洗液中不要包含叠氮钠。

(2) 如果酶标板用于今后使用，必须将之按储存要求而制备。低温储存、冷冻干燥或在包被液中加人糖类或甘油都是可以的。对于任何特定的抗体酶标板，最好的方法是通过经验来决定。

(3) 因为潜在的致癌性，一些酶的底物被认为是有害的。小心操作，参考安全手册，进行适当的预防。注意叠氮化物是剧毒物质。