竞 争 ELISA

「竞 争」ELISA

「竞争」ELISA 比「夹心」ELISA 法需要多做一些工作，但当被检靶抗原分子非常小时 ，它不失为一个好的方法（图 14. 2)。而且，该方法可使用纯度较低的一抗。

在这个试验中，试剂中的一种必须和一可供检测的分子（ 如 ¹²⁵1、 H R P 或者荧光分子) 偶联。这里所述的实验程序中，标记的免疫原被用作为竞争剂。

如夹心法一样，将纯化的抗体包被在 9 6 孔酶标板中。未结合的抗体被洗涤去除，孔内其他蛋白质结合位点用封闭液（常用脱脂奶粉溶液) 进行封闭。分别加人已知浓度的未标记标准品和未知溶液，与一抗共同孵育。当此反应达到平衡后，加人标记的免疫原，它可与那些没有被未标记免疫原封闭的一抗结合。标记的免疫原可进行定量检测，标记抗原的总量与结合的未标记抗原的总量成反比例关系

操作步骤

(1) 每孔中加入 50ju l 稀释的捕获抗体溶液，室温孵育 4 h 或 4°C 过夜。

(2) 用未标记的二抗（每 孔 加 20ug/m l 抗 体 溶 液 50 ul）封闭酶标板未结合位, 为确保完全封闭，4°C 孵育过夜。
(3) PBS 洗 板 2 次 。

(4) 将 3 % 小牛血清白蛋白溶液加满微孔，封闭各孔剩余的蛋白结合位点 [操作注意事项（1)]。室温孵育 2 小时或过夜。

(5) PBS 洗 板 2 次 。

(6) 孔中加入 50 沁标准品或待测样品溶液 。 用封闭液对样品进行稀释。

(7) 孔中加入标记的抗原溶液 50； xl。用封闭液对样品进行稀释。室温孵育 2 h 。

(8) PBS 洗 板 2 次 。

(9) 用合适的方法检测结合的标记物（如 7 计数、荧光强度或用分光光度计检测酶底物的颜色改变）