夹心ELISA
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1. 溶液准备:
包被液:50mM Na2CO3 ( pH9.6 ), 20mMTris-HCl ( pH8.5 ) 或10mM PBS ( pH7.2 )
封闭液:一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等
洗涤液:0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 ( pH7.4 )
AKP偶联的链球菌亲和素溶液:用1×封闭液稀释酶偶联物
2. 实验程序:
1 ) 将捕获抗体包被液稀释至相应的浓度。
2 ) 在对应的孔中加入100μl抗体溶解液,室温孵育2h或4℃过夜。
3 ) 倒空液体并拍干残留液体,用300μl洗涤液清洗两次。
4 ) 每个孔中加300μl封闭液,孵育1h.
5 ) 倒空液体并拍干残留液体,用300μl洗脱液清洗两次。
6 ) 每个孔中加100μl生物素标记的检测抗体,37℃孵育1h或室温孵育3h.
7 ) 倒空液体并拍干残留液体,每个孔中加满洗涤液,倒空液体并拍干残留液体,重复3次。
8 ) 每个孔中加100μl AKP偶联的链球菌亲和素,室温孵育1h.
9 ) 倒空液体并拍干残留液体,每个孔中加满洗脱液,倒空液体并拍干残留液体,重复3次。
10 ) 用洗涤液浸泡5min,拍干残留液体,这一步对于减少背景信号是很重要的。
11 ) 每个孔中加满洗涤液,倒空液体并拍干残留液体,重复5次。
12 ) 每个孔中加100μl底物,显色30min并立即在405-410nm读数。