SPA夹心ELISA实验检测CIC

 

金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。

1、试剂

（1）5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；

（2）牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；

（3）HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物，最适工作浓度以方阵法滴定；

（4）热聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63℃加热20min制成。

2、操作步骤

（1）用PBS稀释SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0.1ml（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用；

（2）待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀，4℃过夜后1600r/min离心20min，弃上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解；

（3）将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD―H₂ 0₂ ）0.1ml，37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH₂ S0₄ 1滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值；

（4）标准曲线制备：取正常人血清0.2ml，加热聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml，置4℃过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线；

（5）结果判断：从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。以高于正常对照X+2S，即大于28.4ug/ml为阳性。

3、注意事项

（1）热聚合人IgC应分装贮存于-20℃，不宜反复冻融，否则易解聚；

（2）PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。