备选方案4：夹心ELISA法检测同种型实验

一、附加材料（其他材料见基本方案）

1. 抗同种型包被抗体：重链特异抗体（抗 μ、α、γ、б、ε）、重链亚类特异抗体（抗 γ1、γ2a、γ2b、γ3、γ4）或轻链同种型特异抗体（抗 γ和 κ）（不可结合显色 剂中的抗体）

2. 标准同种型抗体（如已知同种型纯化抗体）

3. 显色剂：碱性磷酸酶标记抗全部免疫球蛋白重链的特异性抗体

二、实验方法

1. 用PBSN稀释最适浓度抗同种型抗体，配制成2 μg/ml。

   筛选杂交瘤上清液的 IgG（抗γ），应最先配制识别所有同种型 IgG 亚类的包被 抗体，在随后分析中用特异亚类包被抗体。

2. 用 50μl 包被抗体溶液包被 Immulon 微量滴定板的每个孔，并封闭（见基本方案，步骤 3〜5)。

3. 配制大约 500ng/ml 标准同种型抗体溶液作为阳性对照。

4. 转移 50μ1 的待测样品或标准同种型抗体溶液到抗体包被的孔中。每块板上设阴性对 照孔（即未包被待测样本溶液或对照抗体溶液），室温下孵育 2 h 以上，洗涤（见基 本方案，步骤 7）。

5. 配制显色剂，最终显色剂溶液大约含 200ng 抗免疫球蛋白/ml。每孔中加入 50ul 碱性磷酸酶标记抗体（包括阳性和阴性对照组），室温下孵育 2 h，洗涤。

6. 每孔中加入 75μ1 MUP 或 NPP 底物溶液，室温下孵育。定时检查滴定板底物显色作 用（见基本方案，步骤 9; 阳性对照大约 lh），反应弱的孵育数小时后或过夜再行检测。待测溶液需比阴性对照组信号髙出 3 倍以上才可定性为阳性。