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抗补体实验检测与补体结合的CIC

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血清中有免疫复合物存在时,可与其本身的C1(内源性C1)结合。将被检血清56℃加热1h,能破坏结合的C1,空出补体结合位点。当加入豚鼠血清(外源性C1)及指示系统(致敏SRBC)时,CIC又可与外源性C1结合,使致敏SRBC的溶血被抑制。

1、试剂

(1)缓冲生理盐水 NaCl l7.00g,NaaHP04 1.13g,KH2P04 0.27g,蒸馏水溶解至100ml。用时取此液5mL,加蒸馏水95ml,10%硫酸镁0.1ml当日使用;

(2)溶血素 按效价以缓冲盐水稀释至2单位;

(3)2%SRBC新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存的羊血(4℃可保存3周) 用生理盐水洗2次,第三次用缓冲盐水,2500r/min离心lOmin,取压积红细胞用缓冲盐水配成2%悬液。为使SRBC浓度标准化,可将2%悬液用缓冲盐水稀释25倍,于分光光度计(542nm)测定其透光率(以缓冲盐水校正透光率至100%)。每次实验所用SRBC浓度(透光率)必须一致,否则应予调整;

(4)致敏SRBC 2%SRBC悬液加等量1:1000溶血素,混匀,37℃水浴10rain;

(5)豚鼠血清 取3只成年健康豚鼠血清混合分装,每管0.5ml,-30℃保存。用时取出一管,以缓冲盐水作1:100稀释;

(6)热聚合人IgG 将人IgC(10mg/mL)置63℃水浴加热15rain,立即置冰浴内,冷却后过Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱,收集第一蛋白峰。

所获热聚合人IgG可用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。也可取人IgG(10mg/mL)10mL,搅拌下滴加1.8%戊二醛100uL,24h后加入0.4mol/LpH5.4,Tris-HCl缓冲液100uL终止反应,过Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱,用0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液洗脱,收集第一蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0.5%,分装后-40℃保存。试验中可用作阳性对照和制备标准曲线;

(7)50%溶血标准管 致敏SRBC0.4ml加0.6mL蒸馏水使完全溶血后,取0.5ml加缓冲盐水0.5ml

2、操作步骤

(1)将被检血清置56℃水浴1h;

(2)设两排管径、色泽相同的试管(试验排与对照排),每排5支;

(3)加豚鼠血清与缓冲盐水至各管;

(4)试验管每管加被检血清0.1ml,对照各管不加血清,用缓冲盐水0.1ml代替。37℃水浴10rain;

(5)各管加致敏SRBC0.4ml,混匀,置37℃水浴30rain;

(6)将各管1000r/rain离心3min,或置4℃待SRBC自然下沉后观察结果。以上清液与50%溶血管比色。

3、结果判断

以50%溶血管作为判定终点。凡试验排比对照排溶血活性低1管或1管以上者,抗补体试验阳性,提示有免疫复合物存在。每次实验可用热聚合人IgC作阳性对照。

4、注意事项

(1)此方法敏感性较高,可测出每毫升IC的限度为微克(Pg),甚至纳克(ng)水平。其缺点是任何水平上千扰补体反应序列的物质都能引起假阳性结果。补体旁路途径的激活剂(如天然多糖、细菌内毒素等)将产生明显的抗补体活性,血清经过56℃加热,可能会改变某些IC的结构。因此,有人认为单独抗补体实验阳性,尚不足以证实IC的存在。

(2)混合豚鼠血清一般1:100稀释后应用。-30℃保存2周后或在夏季取血,豚鼠补体活性会有所下降。使用前可先滴定,选取0.1mL可引起50%溶血的补体稀释度。

(3)豚鼠血清切忌反复冻融,已融化未用完者宜弃去。

(4)缓冲盐水、2%SRBC悬液、致敏SRBC均应新鲜配制。

(5)被检血清应新鲜,无细菌污染及溶血。如当日不检测应置-30℃冻存。检测前置56℃水浴1h灭活,应严格控制加温温度与时间。

(6)本法只能检出与补体结合的CIC,抗补体的任何因素均能干扰本实验。

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