抗补体实验检测与补体结合的CIC

血清中有免疫复合物存在时，可与其本身的C1（内源性C1）结合。将被检血清56℃加热1h，能破坏结合的C1，空出补体结合位点。当加入豚鼠血清（外源性C1）及指示系统（致敏SRBC）时，CIC又可与外源性C1结合，使致敏SRBC的溶血被抑制。

1、试剂

（1）缓冲生理盐水 NaCl l7.00g，NaaHP04 1.13g，KH2P04 0.27g，蒸馏水溶解至100ml。用时取此液5mL，加蒸馏水95ml，10%硫酸镁0.1ml当日使用；

（2）溶血素 按效价以缓冲盐水稀释至2单位；

（3）2%SRBC新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存的羊血（4℃可保存3周） 用生理盐水洗2次，第三次用缓冲盐水，2500r/min离心lOmin，取压积红细胞用缓冲盐水配成2%悬液。为使SRBC浓度标准化，可将2%悬液用缓冲盐水稀释25倍，于分光光度计（542nm）测定其透光率（以缓冲盐水校正透光率至100%）。每次实验所用SRBC浓度（透光率）必须一致，否则应予调整；

（4）致敏SRBC 2%SRBC悬液加等量1：1000溶血素，混匀，37℃水浴10rain；

（5）豚鼠血清 取3只成年健康豚鼠血清混合分装，每管0.5ml，-30℃保存。用时取出一管，以缓冲盐水作1：100稀释；

（6）热聚合人IgG 将人IgC（10mg/mL）置63℃水浴加热15rain，立即置冰浴内，冷却后过Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱，收集第一蛋白峰。

所获热聚合人IgG可用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。也可取人IgG（10mg/mL）10mL，搅拌下滴加1.8%戊二醛100uL，24h后加入0.4mol/LpH5.4，Tris-HCl缓冲液100uL终止反应，过Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱，用0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，收集第一蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0.5%，分装后-40℃保存。试验中可用作阳性对照和制备标准曲线；

（7）50%溶血标准管 致敏SRBC0.4ml加0.6mL蒸馏水使完全溶血后，取0.5ml加缓冲盐水0.5ml

2、操作步骤

（1）将被检血清置56℃水浴1h；

（2）设两排管径、色泽相同的试管（试验排与对照排），每排5支；

（3）加豚鼠血清与缓冲盐水至各管；

（4）试验管每管加被检血清0.1ml，对照各管不加血清，用缓冲盐水0.1ml代替。37℃水浴10rain；

（5）各管加致敏SRBC0.4ml，混匀，置37℃水浴30rain；

（6）将各管1000r/rain离心3min，或置4℃待SRBC自然下沉后观察结果。以上清液与50%溶血管比色。

3、结果判断

以50%溶血管作为判定终点。凡试验排比对照排溶血活性低1管或1管以上者，抗补体试验阳性，提示有免疫复合物存在。每次实验可用热聚合人IgC作阳性对照。

4、注意事项

（1）此方法敏感性较高，可测出每毫升IC的限度为微克（Pg），甚至纳克（ng）水平。其缺点是任何水平上千扰补体反应序列的物质都能引起假阳性结果。补体旁路途径的激活剂（如天然多糖、细菌内毒素等）将产生明显的抗补体活性，血清经过56℃加热，可能会改变某些IC的结构。因此，有人认为单独抗补体实验阳性，尚不足以证实IC的存在。

（2）混合豚鼠血清一般1：100稀释后应用。-30℃保存2周后或在夏季取血，豚鼠补体活性会有所下降。使用前可先滴定，选取0.1mL可引起50%溶血的补体稀释度。

（3）豚鼠血清切忌反复冻融，已融化未用完者宜弃去。

（4）缓冲盐水、2%SRBC悬液、致敏SRBC均应新鲜配制。

（5）被检血清应新鲜，无细菌污染及溶血。如当日不检测应置-30℃冻存。检测前置56℃水浴1h灭活，应严格控制加温温度与时间。

（6）本法只能检出与补体结合的CIC，抗补体的任何因素均能干扰本实验。