补体结合试验

补体结合试验（complement fixation test，CFT）是经典途径的抗原抗体反应之一。该方法一般用于：①临床病毒性疾病的诊断；②病毒性传染病的流行病学调查；③病毒性抗原及相应抗体的检测；④病毒亚型的鉴定等。

补体结合试验的基本原理是基于：1．有 3 个系统①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）与相应溶血素，形成致敏红细胞。
2．如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而不出现溶血，是为试验阳性。
3．如果反应系统中不存在待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。

补体结合试验一般用于：①临床病毒性疾病的诊断；②病毒性传染病的流行病学调查；③病毒性抗原及相应抗体的检测；④病毒亚型的鉴定等。

器材：

①离心机

②培养箱

③注射器

④细菌滤器

试剂：

①材料：病毒抗原

②豚鼠新鲜血清

③4.1％SRBC

④Alsever 保存液

⑤甘油

⑥稀释液

⑦溶血素

补体结合试验的基本过程可分为如下几步：

（一）材料准备

1．病毒抗原从组织培养、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。

2．抗体免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动物，以免发生交叉反应。血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性。来源于人和豚鼠的抗体，灭活温度为 56 ℃；来源于家兔和马的抗体，灭活温度为 65 ℃。

3．补体检测人和哺乳动物血清，应用豚鼠新鲜血清补体，临用前制备。
4.1％SRBC 制备从绵羊颈静脉无菌操作采血，放入含有 Alsever 保存液的三角烧瓶中（Alsever 液与羊血比例为 1：1），立即摇晃均匀 4℃ 冰箱保存备用，可使用 2～3 周。使用时用 10 倍体积生理盐水洗涤三次，每次以 2000 r／min 离心 10 分钟，吸取离心沉积的红细胞 1 mL，再加 99 mL 生理盐水，即成 1％ 的红细胞悬液。

5．溶血素用绵羊红细胞免疫家兔，效价达到 1：4000 可获得；56 ℃ 30 分钟灭活，加甘油后长期保存。

6．稀释液含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定。

（二）所用试剂的滴定

1．溶血素的滴定 先将溶血素稀释成 1：1000～1：100 的稀释液，再依次加入溶血素 0.1 mL，钙镁盐水 0.2 mL，1：60 补体 0.2 mL、1％ 绵羊红细胞 0.1 mL，混匀后再水浴。
结果判定：完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细胞；不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色透明。
溶血素效价的测定：以完全溶血的最高稀释倍数确定为 1 个单位。

2．确实单位（exact unit）将完全溶血的最小补体量作为一个「确实单位」，1：60 补体最小量 0.12 mL 可产生完全溶血，为 1 个确实单位。正式试验时使用 2 个确实单位。（2x0.12）：60＝0.2：X，得 X＝50，即实际应用中的 2 个补体确实单位为 1：50 的补体 0.2 mL。
补体的滴定：补体不稳定，每次试验前需滴定。

（三）抗原和抗体的滴定

1．找出抗原和抗体最佳比例，用方阵滴定法。

（1）将抗原和抗血清经 56 ℃ 30 分钟灭活补体后，用钙镁盐水分别将抗原和抗体进行倍比稀释（1：521～1：8）。

（2）横向前 7 排管中加不同稀释度的抗原 0.1 mL；纵向前 7 列管中加不同稀释度的抗血清溶液 0.1 mL；第八排管和第 8 列管中另补充钙镁盐水各 0.1 mL。

（3）各管加含两个确实单位的补体 0.2 mL。

（4）4 ℃ 冰箱过夜。因为一般来说，在 4 ℃ 冰箱过夜较 37 ℃1 小时可固定更多的补体，且比较敏感方便，故大多数采用 4 ℃ 冰箱过夜。

（5）最后加致敏 SRBC。

（6）结果判定：选择抗原和抗体呈强阳性反应（完全不溶血）的最高稀释度作为抗体的效价；由表 4-6 可知 1：64 的抗原和 1：32 的抗血清分别为 1U；正式试验中，抗原一般用 2～4U（1：32～1：16），抗血清用 4U（1：8）。

2．正式试验

（1）配制各种试剂。

（2）阴性和阳性对照应分别为明确的溶血和不溶血。

（3）补体对照管中 2U 应全溶，若不完全溶血表明补体量不够，0.5U 应不溶，若完全溶血则表明补体含量过多。

（1）抗原和抗体纯度和滴度要够；补体保存应低温保存，不要反复冻融；补体含量常用 0.5～2U。