夹心法 ELISA 操作步骤

实验开始前，各试剂和样本均应平衡至室温；样本复融后需再次离心，取上清检测；试剂或样本配制时，需充分混匀并尽量避免起泡；标曲和样本建议做复孔检测。

1. 加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔 100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔 100 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃ 孵育 90 分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在 10 分钟内。

1. 生物素化抗体/抗原：弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液 100 μL，混匀，酶标板加上覆膜， 37℃ 孵育 1 小时。

1. 洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液 350 μL，浸泡 1-2 分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤 3 次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

1. HRP 酶结合物：每孔加酶结合物工作液 100 μL，混匀，加上覆膜，37℃ 孵育 30 分钟。

1. 洗涤：弃去孔内液体，洗板 5 次，方法同步骤 3。

1. 底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混匀，加上覆膜，37℃ 避光孵育 15 分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过 30 分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

1. 终止：每孔加终止液 50 μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

1. 读值：立即用酶标仪在 450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热，设置好检测程序。

1. 实验完毕后，将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。