双抗体夹心ELISA法检测待测样品sIL-2R含量
【基本原理】
选用两株针对sIL-2R分子不同位点的单克隆抗体,即McAb1 (包被抗体)与McAb2 (酶标抗体)。先用McAb1 包被固相载体,使待测sIL-2R与之特异性结合,然后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的McAb2 ,则形成McAb1 -sIL-2R-HRP标记McAb2 复合物,再加入HRP底物(邻苯二胺),则酶催化底物而显色,测定样品与标准品OD值,绘制标准曲线,即可从标准曲线中查得待测样品中sIL-2R含量。该法敏感性高,且特异、简便、快速、取材容易,故较为常用。
【材料和试剂】
(1) 包被抗体(McAb1 ):使用时用包被液作适当稀释(如1:100)。
(2) 酶标抗体(McAb2 ):以辣根过氧化物酶(HRP)标记。使用时用稀释液做
适当稀释,其稀释度根据预试验结果而定。
(3) sIL-2R标准品:已知含量的sIL-2R,使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度:1600u/ml, 800u/ml, 400u/ml, 200u/ml, 100u/ml, 50u/ml, 25u/ml
(4) 待测样品:如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液等均可用于检测sIL-2。
(5) 阴性对照品:未免疫小鼠IgG
(6) PBS(0.01mol/L, pH7.4的磷酸盐缓冲液)
(7) 包被液(0.05 mol/L, pH9.6的磷酸盐缓冲液)
(8) 稀释液(含10% BSA的PBS)
(9) 洗涤液(0.05% Tween20-PBS)
(10) 底物缓冲液(0.1 mlo/L, pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)
(11) HRP底物:邻苯二胺(OPD)
(12) 3% H2 O2
(13) 底物显色液(OPD-H2 O2 ):临用前配制,4℃避光保
(14) 终止液(2 mol/L H2 SO4 )
(15) 96孔酶标板,酶标测定仪,495nm滤光片
(16) 其他:4℃冰箱,水浴箱,刻度吸管,毛细吸管,加样器及吸头
【操作步骤】
(1) 包被:将用包被液稀释好的McAb1 (5-10μg/ml)加入96孔酶标板,100μl/孔,置37℃ 2h后移置4°C过夜(16-72h);
(2) 洗涤:将96孔酶标板倾去包被液,用洗涤液加满各孔,置3min,然后弃去,反复洗涤3次
(3) 加样(均设双复孔):
①将已知含量的sIL-2R标准吕用稀释液作倍比稀释后,分别加入1-7孔,100μl/孔,按浓度从低到高的顺序依次加样;
②第8孔加入待测样品,100μl;
③第9孔加阴性对照血清(未免疫小鼠IgG),100μl;
④第10孔为空白对照(稀释液),100μl;
(4) 加样后,置室温孵育1-2h;
(5) 洗涤3次,方法同前。
(6) 各孔加入HRP标记的McAb2 ,用稀释液作适当稀释其稀释度根据预试验结果确定,100μl/孔;
(7) 置37℃孵育1~2h;
(8) 洗涤3次,方法同前;
(9) 显色:各孔加新鲜配制的OPD-H2 O2 显色液,100μl/孔,置室温或37℃下避光反应15-30min;
(10) 终止反应:各孔加2mol/L H2 SO4 ,50μl/孔
(11) 测定OD值:用酶标测定仪以波长495nm测定各孔OD值。
【结果判断】
(1) 空白对照及阴性对照孔应无色,各阳性孔呈现棕黄色,且sIL-2R标准品各孔呈明显颜色由浅到深梯度改变。
(2) 绘制标准曲线:以标准品各稀释度sIL-2R含量为横座标(X),相应的OD值为纵座标(Y),在普通座标纸上绘制标准曲线。
(3) 根据待测样品孔的OD值,在标准曲线上查得待测样品sIL-2R含量。
【注意事项】
(1) 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须离心去除,勿用溶血或血脂过高的血清检测sIL-2R。
(2) 待测样品在4℃可放置一周,如不立即检测应置于-20℃或-70℃冰箱中,且应避免反复冻融,宜分装保存。
(3) sIL-2R标准品质量直接影响检测结果的准确性,应注意商品试剂盒中的sIL-2R标准品可随时间延长而降低效价。
(4) 叠氮钠(NaN3 )对辣根过氧化物酶有灭活作用,在本实验系统中应避免使用。
(5) 底物显色液应在临用前配制,4℃避光保存,H2 O2 应置2-8℃,保存6个月以内。加入底物显色15-30min后应立即测定OD值。
(6) 分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉使用。
(7) 避免孔中有气泡,以免影响所测OD值的准确性。
(8) 因不同来源的样品,不同实验室所测得的sIL-2R含量不同,故sIL-2R正常标准难以统一。可进行大样本测定,以X+ 2SD确定自己实验室各种来源检测样品的参考值范围。在临床观察中,一般以sIL-2R水平升高有意义,故可设立X+2SD为正常值上限。一般用ELISA法测定血清时,sIL-2R水平<200~300u/ml。