双抗体夹心ELISA法检测待测样品sIL-2R含量
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双抗体夹心ELISA法检测待测样品sIL-2R含量
【基本原理】
选用两株针对sIL-2R分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1 （包被抗体）与McAb2 （酶标抗体）。先用McAb1 包被固相载体，使待测sIL-2R与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2 ，则形成McAb1 -sIL-2R-HRP标记McAb2 复合物，再加入HRP底物（邻苯二胺），则酶催化底物而显色，测定样品与标准品OD值，绘制标准曲线，即可从标准曲线中查得待测样品中sIL-2R含量。该法敏感性高，且特异、简便、快速、取材容易，故较为常用。
【材料和试剂】
（1） 包被抗体（McAb1 ）：使用时用包被液作适当稀释（如1：100）。
（2） 酶标抗体（McAb2 ）：以辣根过氧化物酶（HRP）标记。使用时用稀释液做
适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。
（3） sIL-2R标准品：已知含量的sIL-2R，使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度：1600u/ml， 800u/ml， 400u/ml， 200u/ml， 100u/ml， 50u/ml， 25u/ml
（4） 待测样品：如血清、血浆、尿液、细胞培养上清液等均可用于检测sIL-2。
（5） 阴性对照品：未免疫小鼠IgG
（6） PBS（0.01mol/L， pH7.4的磷酸盐缓冲液）
（7） 包被液（0.05 mol/L， pH9.6的磷酸盐缓冲液）
（8） 稀释液（含10% BSA的PBS）
（9） 洗涤液（0.05% Tween20-PBS）
（10） 底物缓冲液（0.1 mlo/L， pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）
（11） HRP底物：邻苯二胺（OPD）
（12） 3% H2 O2
（13） 底物显色液（OPD-H2 O2 ）：临用前配制，4℃避光保
（14） 终止液（2 mol/L H2 SO4 ）
（15） 96孔酶标板，酶标测定仪，495nm滤光片
（16） 其他：4℃冰箱，水浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器及吸头
【操作步骤】
（1） 包被：将用包被液稀释好的McAb1 (5-10μg/ml)加入96孔酶标板，100μl/孔，置37℃ 2h后移置4°C过夜（16-72h）；
（2） 洗涤：将96孔酶标板倾去包被液，用洗涤液加满各孔，置3min，然后弃去，反复洗涤3次
（3） 加样（均设双复孔）：
①将已知含量的sIL-2R标准吕用稀释液作倍比稀释后，分别加入1-7孔，100μl/孔，按浓度从低到高的顺序依次加样；
②第8孔加入待测样品，100μl；
③第9孔加阴性对照血清（未免疫小鼠IgG），100μl；
④第10孔为空白对照（稀释液），100μl；
（4） 加样后，置室温孵育1-2h；
（5） 洗涤3次，方法同前。
（6） 各孔加入HRP标记的McAb2 ，用稀释液作适当稀释其稀释度根据预试验结果确定，100μl/孔；
（7） 置37℃孵育1～2h；
（8） 洗涤3次，方法同前；
（9） 显色：各孔加新鲜配制的OPD-H2 O2 显色液，100μl/孔，置室温或37℃下避光反应15-30min；
（10） 终止反应：各孔加2mol/L H2 SO4 ，50μl/孔
（11） 测定OD值：用酶标测定仪以波长495nm测定各孔OD值。
【结果判断】
（1） 空白对照及阴性对照孔应无色，各阳性孔呈现棕黄色，且sIL-2R标准品各孔呈明显颜色由浅到深梯度改变。
（2） 绘制标准曲线：以标准品各稀释度sIL-2R含量为横座标（X），相应的OD值为纵座标（Y），在普通座标纸上绘制标准曲线。
（3） 根据待测样品孔的OD值，在标准曲线上查得待测样品sIL-2R含量。
【注意事项】
（1） 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须离心去除，勿用溶血或血脂过高的血清检测sIL-2R。
（2） 待测样品在4℃可放置一周，如不立即检测应置于-20℃或-70℃冰箱中，且应避免反复冻融，宜分装保存。
（3） sIL-2R标准品质量直接影响检测结果的准确性，应注意商品试剂盒中的sIL-2R标准品可随时间延长而降低效价。
（4） 叠氮钠（NaN3 ）对辣根过氧化物酶有灭活作用，在本实验系统中应避免使用。
（5） 底物显色液应在临用前配制，4℃避光保存，H2 O2 应置2-8℃，保存6个月以内。加入底物显色15-30min后应立即测定OD值。
（6） 分别用加样器头吸取各份标本，避免相互交叉使用。
（7） 避免孔中有气泡，以免影响所测OD值的准确性。
（8） 因不同来源的样品，不同实验室所测得的sIL-2R含量不同，故sIL-2R正常标准难以统一。可进行大样本测定，以X+ 2SD确定自己实验室各种来源检测样品的参考值范围。在临床观察中，一般以sIL-2R水平升高有意义，故可设立X+2SD为正常值上限。一般用ELISA法测定血清时，sIL-2R水平＜200～300u/ml。
