ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量
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ELISA 抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量
【基本原理】
本法是用纯化或重组的IL-2R(α链，P55，CD25，Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板，同时加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照，从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。
【材料和试剂】
（1） 纯化或重组的IL-2R蛋白（α链，P55，CD25，Tac抗原）（40.000u/ml）
（2） FITC标记的抗IL-2R McAb（0.2μg/ml）：FITC为异硫氰酸荧光素，这里仅作为半抗原使用，而不作为荧光素标记。
（3） 碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体（酶标抗体）
（4） 对硝基苯磷酶盐底物液；用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解，配成浓度为1mg/ml。
（5） 1%牛血清白蛋白-PBS（1%BSA-PBS）：为封闭液点稀释液
（6） 不同倍比稀释度的sIL-2R标准品：以1% BSA-PBS稀释。
（7） 洗涤液（0.05%Tween20-PBS）
（8） 待测sIL-2R样品
（9） 96孔酶标板（聚苯乙烯板），酶标仪，波长465nm滤光片
（10） 刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），4℃冰箱
【操作步骤】
（1） 以一定浓度的纯化或重组的IL-2R（P55）蛋白包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃过夜（16-72h）；
（2） 弃包被液，用1%BSA-PBS封闭非特异性结合位点，200ul/孔，置室温2h；
（3） 用洗涤液加满各孔置3min，然后倾去，反复洗涤3次；
（4） 分别加入不同稀释度的sIL-2R标准品及待测样品，50μl/孔；
（5） 各孔均加入FITC标记的IL-2R McAb，50μl/孔，充分混匀后置室温2h；
（6） 同上洗涤3次；
（7） 各孔均加入碱性磷酶酶标记的兔抗FITC抗体，100μl/孔，置室温1h；
（8） 同上洗涤3次；
（9） 各孔均加入底物液，100μl/孔，置室温15-30min；
（10） 用酶标仪以波长405nm测各孔OD值。
【结果分析】
（1） 以sIL-2R标准品各稀释度对应的浓度值为横座标（X），相应的OD值为纵座标（Y），在普通座标纸上绘制竞争抑制标准曲线，OD值随标准品sIL-2R浓度升高而降低。
（2） 根据待测样品所测得的OD值，在标准曲线上查得样品sIL-2R含量。
（3） 本方法测定sIL-2R含量时，不需要计算抑制百分率。
【注意事项】
（1） 本方法的敏感度低，大约为5000u/ml，大大低于双抗体夹心ELISA法（10u/m）。因此不适合检测正常人标本中sIL-2R含量，仅适用于检测sIL-2R含量极度增高的样品，如接受抗IL-2R抗体治疗、毛细胞性白血病等患者标本，或作为监测移植排斥反应的一个指标。
（2） 若无纯化或重组的IL-2R蛋白，可用PHA刺激的外周血单个核细胞（或MT-2细胞）包被96孔酶标板，吹干，固定，再用1% H2 O2 处理以抑制内源性过氧化物酶后即可使用。
（3） 其余多见双抗夹心ELISA法测定sIL-2R含量部分。
（4） 试剂配制多参见TNF-α的免疫学检测部分。
