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ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量

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ELISA 抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量
 
【基本原理】
本法是用纯化或重组的IL-2R(α链,P55,CD25,Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板,同时加入已知量的抗IL-2RMcAb,再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照,从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。
【材料和试剂】
(1)         纯化或重组的IL-2R蛋白(α链,P55,CD25,Tac抗原)(40.000u/ml)
(2)         FITC标记的抗IL-2R McAb(0.2μg/ml):FITC为异硫氰酸荧光素,这里仅作为半抗原使用,而不作为荧光素标记。
(3)         碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体(酶标抗体)
(4)         对硝基苯磷酶盐底物液;用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解,配成浓度为1mg/ml。
(5)         1%牛血清白蛋白-PBS(1%BSA-PBS):为封闭液点稀释液
(6)         不同倍比稀释度的sIL-2R标准品:以1% BSA-PBS稀释。
(7)         洗涤液(0.05%Tween20-PBS)
(8)         待测sIL-2R样品
(9)         96孔酶标板(聚苯乙烯板),酶标仪,波长465nm滤光片
(10)      刻度吸管,毛细吸管,加样器(头),4℃冰箱
【操作步骤】
(1)         以一定浓度的纯化或重组的IL-2R(P55)蛋白包被96孔酶标板,100ul/孔,4℃过夜(16-72h);
(2)         弃包被液,用1%BSA-PBS封闭非特异性结合位点,200ul/孔,置室温2h;
(3)         用洗涤液加满各孔置3min,然后倾去,反复洗涤3次;
(4)         分别加入不同稀释度的sIL-2R标准品及待测样品,50μl/孔;
(5)         各孔均加入FITC标记的IL-2R McAb,50μl/孔,充分混匀后置室温2h;
(6)         同上洗涤3次;
(7)         各孔均加入碱性磷酶酶标记的兔抗FITC抗体,100μl/孔,置室温1h;
(8)         同上洗涤3次;
(9)         各孔均加入底物液,100μl/孔,置室温15-30min;
(10)      用酶标仪以波长405nm测各孔OD值。
【结果分析】
(1)         以sIL-2R标准品各稀释度对应的浓度值为横座标(X),相应的OD值为纵座标(Y),在普通座标纸上绘制竞争抑制标准曲线,OD值随标准品sIL-2R浓度升高而降低。
(2)         根据待测样品所测得的OD值,在标准曲线上查得样品sIL-2R含量。
(3)         本方法测定sIL-2R含量时,不需要计算抑制百分率。
【注意事项】
(1)         本方法的敏感度低,大约为5000u/ml,大大低于双抗体夹心ELISA法(10u/m)。因此不适合检测正常人标本中sIL-2R含量,仅适用于检测sIL-2R含量极度增高的样品,如接受抗IL-2R抗体治疗、毛细胞性白血病等患者标本,或作为监测移植排斥反应的一个指标。
(2)         若无纯化或重组的IL-2R蛋白,可用PHA刺激的外周血单个核细胞(或MT-2细胞)包被96孔酶标板,吹干,固定,再用1% H2 O2 处理以抑制内源性过氧化物酶后即可使用。
(3)         其余多见双抗夹心ELISA法测定sIL-2R含量部分。
(4)         试剂配制多参见TNF-α的免疫学检测部分。
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