间接免疫荧光法检测样品中mIL-2Rα+阳性细胞
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间接免疫荧光法检测样品中mIL-2R α + 阳性细胞
白介素2受体（interleukin 2 receptor， IL-2R）是能与白介素2（IL-2）特异性结合的细胞受体。IL-2R由α、β、γ链组成。IL-2R存在形成包括膜结合型IL-2R（membrane-bound IL-2R，mIL-2R）与可溶性IL-2R（solubble IL-2R，sIL-2R）。sIL-2R是由于某种因素（如位点特异性蛋白酶裂解作用）使mIL-2R α链（P55，CD25，Tac抗原）脱落进入体液而形成，（是mIL-2R的清除形式之一）。体液中sIL-2Rα升高是抗原强烈刺激的标志以及T淋巴细胞活化的标志。sIL-2R由mIL-2R+ T细胞释放，可存在于血清、尿液及淋巴细胞培养上清液中。应用标记的抗IL-2R特异性抗体和抗原抗体反应可检测待测样品中sIL-2R含量，也可检测mIL-2R。目前多以双抗体夹心ELISA法或ELISA抗原竞争法检测sIL-2R含量，以间接免疫荧光法或放射免疫法检测mIL-2R。
【基本原理】
利用抗IL-2Rα McAb(一抗)与细胞膜表面的mIL-2R特异性结合，再选用FITC标记的（羊或兔）抗小鼠IgG(二抗)与一抗特异性结合，即可借助荧光显微镜直接观察或利用流式细胞术（如FACS）分辨并检测出来一细胞群体中mIL-2Rα+ 细胞比例。下面检测人ＰＢＭＣ表面的mIL-2Rα为例。
【材料和试剂】
（1） 一抗：任意一株抗IL-2Rα McAb， 例如测定人源细胞mIL-2Rα 时，多选用抗Tac McAb (Tac即为IL-2Rα 链，P55，CD25)。
（2） 二抗：FITC标记的羊（或兔）抗小鼠IgG，使用时作适当稀释（如1：8或1：16），稀释液为1% BSA-PBS。
（3） 待测细胞（如PHA刺激的人外周血淋巴细胞）：用5% FCS-Hanks液调浓度为1×107 /ml，细胞存活率应>95%。
（4） 人Ig（封闭非特异性结合位点）
（5） 5% FCS-Hanks液，1% BSA-PBS液
（6） 1%多聚甲醛
（7） 小试管（10×75�），刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），细胞计数板，倒置显微镜，4℃冰箱，载玻片，盖玻片，离心机。
（8） 荧光显微镜或流式细胞仪。
【操作步骤】
（1） 将待测细胞（PHA刺激的人PBMC）加入小试管中，100μl/管，即1×106 /管；
（2） 向试管内加入人Ig，100μl/管，孵育15min，以去除抗体的Fc段非特异性结合（此步可省去）；
（3） 加入抗Tac McAb(一抗)，1μg/100μl/管，4℃孵育30-60min；
（4） 加入2ml冷的5% FCS-Hanks洗涤2-3次，1500r/min离心5min；
（5） 加入适量稀释的FITC标记的羊（或兔）抗小鼠IgG（二抗），100μl/管，4℃孵育30min；
（6） 加入2ml的5% FCS-Hanks洗涤2-3次，1500r/min离心5min；
（7） 进行FACS分析，分析荧光阳性细胞百分比及平均荧光强度；
（8） 或者：用1%多聚甲醛固定细胞后，用毛细吸管吸取固定后的细胞滴加于截玻片上，用荧光显微镜计数荧光阳性细胞，计数荧光阳性细胞百分比。
【结果分析】
（1） FACS不仅可以分析荧光阳性细胞的（mIL-2Rα + 细胞）百分比，还可进行细胞分离。
（2） 用荧光显微镜计数时，应先用普通显微镜（普通光源下）计数视野中淋巴细胞总数，每份标本应至少计数200个淋巴细胞，然后再用荧光显微镜（荧光光源下）计数荧光阳性细胞（mIL-2Rα+ 细胞）数，最后计算出mIL-2Rα+ 细胞数百分比。
（3） 荧光阳性细胞特点是：在细胞膜上可见明亮的黄绿色斑点状或半月形（帽状）荧光，有时亦可到整个细胞膜周围呈环状荧光，均为荧光阳性细胞（即mIL-2Rα + 细胞）。
【注意事项】
（1） 待测细胞活性应>95%。
（2） 应去除样品中的红细胞，以免影响结果。
（3） 混杂的多形核细胞亦可呈现片状或均匀的荧光染色，应在普通光源下（普通显微镜下）加以区分与排除。
（4） 计数细胞时应使用高倍镜头观察。
（5） 还可用放射性同位数（125 I）标记的抗IL-2Rα McAb进行放射免疫分析检测待测细胞膜表面的mIL-2Rα 。
