原理
固定细胞，顺序加入一抗和二抗，通过 UV 光观察。
材料与仪器
细胞培养在盖玻片 产生一抗种属的二抗 猪血清或其他封闭剂 D-PBSA
新鲜制备的固定剂 用含10%的FBS培养液 封固剂
新鲜制备的固定剂 用含10%的FBS培养液 封固剂
步骤
1. 用 D-PBSA 洗涤长有细胞的盖玻片，置于合适的培养皿中。如 13 mm 盖玻片可用24 孔板。
2. 将培养皿置于 -20°C，10 min，再加入冷的固定剂（5 % 醋酸乙醇溶液（放在 -20°C ）），静置 20 min 。
3. 去除固定剂，在 D-PBSA 中洗盖玻片，加入 1 ml 正常猪血清，室温下放置 20 min。
4. 用 D-PBSA 中淋洗盖玻片，用吸水纸吸干，将盖玻片翻转，置于一滴 50 μl 已稀释的一抗（用含10 % 的 FBS 培养液，按1：100~1：1000比例稀释）上。
5. 37°C 下放置 30 min 后，室温 1~3 小时或 4°C 过夜，若在4°C 孵育，抗体可稀释到 1：1000。
6. 用 D-PBSA 中淋洗盖玻片，转移到按 1：20 稀释的二抗（对应于不同的产生一抗种属的二抗（如一抗由兔产生，则二抗应来自不同种动物，如山羊抗兔免疫球蛋白）；二抗用荧光素或罗丹明标记）中，37°C 20 min。
7. 用 D-PBSA 中淋洗盖玻片，用含 50 % 甘油和荧光淬灭延迟剂（Vecta）的 D-PBSA 封间于载玻片上。
8. 用荧光显微镜观察玻片。
2. 将培养皿置于 -20°C，10 min，再加入冷的固定剂（5 % 醋酸乙醇溶液（放在 -20°C ）），静置 20 min 。
3. 去除固定剂，在 D-PBSA 中洗盖玻片，加入 1 ml 正常猪血清，室温下放置 20 min。
4. 用 D-PBSA 中淋洗盖玻片，用吸水纸吸干，将盖玻片翻转，置于一滴 50 μl 已稀释的一抗（用含10 % 的 FBS 培养液，按1：100~1：1000比例稀释）上。
5. 37°C 下放置 30 min 后，室温 1~3 小时或 4°C 过夜，若在4°C 孵育，抗体可稀释到 1：1000。
6. 用 D-PBSA 中淋洗盖玻片，转移到按 1：20 稀释的二抗（对应于不同的产生一抗种属的二抗（如一抗由兔产生，则二抗应来自不同种动物，如山羊抗兔免疫球蛋白）；二抗用荧光素或罗丹明标记）中，37°C 20 min。
7. 用 D-PBSA 中淋洗盖玻片，用含 50 % 甘油和荧光淬灭延迟剂（Vecta）的 D-PBSA 封间于载玻片上。
8. 用荧光显微镜观察玻片。
来源：丁香实验
