间接免疫荧光法测抗体

一、基本原理：

染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30 min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG. IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。

二、试剂与仪器：

1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01 mol/L，pH7.4。

2. 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2，0.2 M碳酸盐缓冲液1份配制。

3. 荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01 mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。

4. 搪瓷桶三只（内有0.01 mol/L，pH7.4的PBS 1500 ml）。

5. 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）。

6. 荧光显微镜。

7. 玻片架。

8. 滤纸。

9. 37℃温箱等。

三、 实验步骤：

1. 滴加0.01 mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。

2. 滴加以0.01 mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片.将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30 min。

3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01 mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01 mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡 。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。

5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30 min。

6. 重复操作3。

7. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

8. 荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

四、注意事项：

1. 荧光染色后一般在1 h内完成观察，或于4℃保存4 h，时间过长 ，会使荧光减弱。

2. 每次试验时 ，需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物。

（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物。

（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色