活细胞间接免疫荧光法

一．实验器材：

1 ．   器材：

40 孔塑料板、 40 孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜等

2 ．   试剂：

单抗隆抗体（单抗）、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、 PBS （ pH7.2-7.4 ）、甘油、叠氮钠（ NaN3 ）等

 

二．方法（微量法）

1 ．   将分离好的单个核细胞用 PBS 洗 2 次， 1000rpm 每次 10 分钟。用含 0.1% NaN3 PBS 调细胞浓度在 0.5-1 × 108/ml （ 5000 万 -1 亿 /ml ），加在 40 孔板上，每孔 10ul ，含 5-10 × 105 细胞，然后加入单抗（第一抗体） 50ul （同时加入 AB 型血清 5ul ）振荡混匀，置 4 ℃ ，至少 30 分钟。

2 ．   用含 0.1%NaN3 的 PBS 洗一次， 1000rpm 离心 3-5 分钟弃上清。

3 ．   加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液 20ul ，混匀振荡置 4 ℃ /30 分钟（时间不能超过）。

4 ．   用含 0.1%NaN3 的 PBS 洗 2 次，方法同上，弃上清，加入含 60% 甘油的 PBS5-10ul （依据所加细胞量而定）振荡均匀，点片，并加盖玻片。

如想次日看结果可在第三步后每孔加入 1% 多聚甲醛 PBS 每孔

50ul ，混匀置 4 ℃ 过夜，次日离心弃上清按四步做法观察结果（为膜荧光）。