活细胞间接免疫荧光法实验操作方法

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一.实验器材：

1. 器材：40孔塑料板、40孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜 等。

2. 试剂：单抗隆抗体(单抗)、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、PBS (pH7.2-7.4)、甘油、叠氮钠(NaN3)等。

二.方法(微量法)

1. 将分离好的单个核细胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分钟。用含0.1% NaN3 PBS调细胞浓度在0.5-1×108/ml(5000万-1亿/ml)，加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105细胞，然后加入单抗(第一抗 体)50ul(同时加入AB型血清5ul)振荡混匀，置4℃，至少30分钟。

2. 用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm离心3-5分钟弃上清。

3. 加荧光标记抗鼠抗体(第二抗体)工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟(时间不能超过)。

4. 用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，弃上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul(依据所加细胞量而定)振荡均匀，点片，并加盖玻片。如想次日看结果可在第三步后每孔加入1%多聚甲醛PBS每孔50ul，混匀置4℃过夜，次日离心弃上清按四步做法观察结果(为膜荧光)。