原理
图1:间接法测抗体示意图
间接法首先用抗原包被于固相载体,这些包被的抗原必须是可溶性的,或者至少是极微小的颗粒,经洗涤,加入含有被测抗体之标本,再经孵育洗涤后,加入酶标记抗抗体,(对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM),再经孵育洗涤后,加底物显色,底物降解的量,即为欲测抗体的量,其结果可用目测或用分光光度计定量测定,本法用同种抗原包被固相载体后,只要用一种酶标记抗人球蛋白,即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人IgM,则可用于早期诊断。
材料与仪器
PBS 包被缓冲液 硫酸 柠檬酸
96孔板 酶标比色计 移液枪 离心管 离心管盒
步骤
注意事项
1.应注意分离血清时,血液要求放置室温中凝固收缩,不宜置冰箱(4℃)中凝固,否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。
2.为了使特异性结合的抗体量尽可能多,包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。
3.在孵育或洗涤过程中,已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处,增加本底颜色,产生假阳性反应。
4.在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂可用来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。
5.在稀释剂和洗涤剂中所加的吐温-20很重要。它不仅能消除非特异性的本底反应,而且还可增加阳性标本的敏感度,这可能与吐温-20能分离所吸附的非特异性物质有关。目前采用的洗涤剂为PH7.4 PBS(含0.2‰KCL)加0.05%吐温-20,如无吐温-20,也可用吐温故-40或吐温-60代替。但吐温-80本底较高,不宜应用。
常见问题
血清、血浆或其他体液,均可作为ELISA的试验样品(标本)。但应注意分离血清时,血液要求放置室温中凝固收缩,不宜置冰箱(4℃)中凝固,否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜,若要贮藏,必须少量分装保存于低温冰箱,并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血,而血清可用滤纸片法采血。
为了使特异性结合的抗体量尽可能多,包被微量反应板凹孔的抗原应该稍微过量。但在孵育或洗涤过程中,已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来。从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处,增加本底颜色,产生假阳性反应,这是限制ELISA特异性的一个因素。因此不少学者在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。已经证明牛血清白蛋白(BSA)和吐温-20有良好的封阻作用。其加入的量BSA为0.5%~1%;吐温-20为0.05%。(有人曾经比较了四种洗涤剂,结果认为蒸馏水加0.05%吐温-20或0.02 mol/L PBS(PH7.4)加0.05%吐温-20都是良好的)。在一般的洗涤剂和稀释剂中还加有NaN3防腐,但是用HRP制备酶结合物时则不能加NaN3,因NaN3能抑制HRP的活性,需要注意BSA加入洗涤剂或稀释剂中虽可改善ELISA的结果观察,但由于BSA比较昂贵,又不易得到,故也不是非加不可的。有人在洗涤剂中加入0.1%白明胶,2%免血清,有利于加强封阻作用。最近有人报告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl缓冲液中加入0.05%吐温-20作洗涤剂,效果很好,被检血清和酶结合物的稀释剂,可与洗涤剂相同,但不需加0.2‰的KCl。
来源:丁香实验