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细胞因子的ELISA检测常采用双抗体夹心的方法进行检测,采用抗同一细胞因子不同表位的两株单克隆抗体,或一个单克隆抗体和一个多克隆抗体。一个抗体用于包被作捕获抗体,另一个抗体标记酶,作为检测抗体。
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双抗夹心法
1)包被:将细胞因子抗体吸附在酶标板表面,形成固相抗体。
2)用封闭液中的蛋白如牛血清白蛋白封闭标板表面剩余的吸附位点。以避免对后线测定中抗原抗体的非特异性吸附。
3)加入被测标本进行孵育,则其中的被测细胞因子就与固相上的抗体发生特异性结合,不发生结合的其他成分可通过洗涤去除。
4)加入辣根过氧化物醇 HRP 标记的抗细胞因子抗体进行孵育,则酶标抗体也与细胞因子发生特异性结合。被结合的酶标抗体的数量与细胞因子的浓度成正比。
5)洗涤去除多余的酶标抗体,再加入酶催化的底物,在酶的催化下,底物形成有色产物。
6)作用一定时间后,终止酶促反应。测定产物颜色,可以反应酶浓度高低,间接反映被测细胞因子的浓度。通过已知标准样品的对照,就可以推算出待测细胞因子的浓度。
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一般双抗体夹心法:首先使用过量细胞因子特异性的抗体包被酶标板,再加入检测样品或标准品,之后使用与包被抗体目标位点不同的hrp标记(或其他酶标记)的二抗使之与捕获到的细胞因子结合。最后利用酶催化反应,通过显色和分光光度计,确定不同检测样本的读数,使用已知浓度标准品和读数绘制标准曲线,再计算检测样品的浓度。
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