竞争法测抗原

本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程，称为包被（Coated），也可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。

 

这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。

一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。

 

二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
 

三、分2组，a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2 ml，b组只加酶标记抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）
 

四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
 

五、加入0.2 ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。
 

六、加终止剂：每凹孔加2 M H₂SO₄或2 M柠檬酸0.05 ml。
 

七、用酶标比色计测定a、b两组OD值，并求出a、b、OD值的差数。

一、影响ELISA的因素

1.  试验的重复性（精确度）

有二种方法来检验试验的精确度：通常用变异系数来表示：1、几个样品用ELISA法同时进行多次测定求出CV%；2、不同时间对不同操作者对某几个样进行多次测定求出变异系数。CV是个体参数标准差与平均数的比率。

S / X ＝ CV ，CV应低10%，不应大于10～15%。

不论目测或分光光度计测定，均可作一个稀释度或一系列稀释度测定，一般常规诊断只用一个稀释度判断阳性或阴性就可以了，这样比较方便，现在推荐传染病的血清诊断用1：200一个稀释度。有些需要精确定量的，可作一系列稀释度测定。

记录结果有下列几种方法：

1、“+”或“-”：所有超过规定的OD值（如OD，0.4）的标本均属阳性，此规定OD值是根据事先测定大量阴性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以一组阴性标本OD平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。

2、直接以OD值来表示，如0.4、0.7、1.2，OD值越大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。

3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该标本的滴度。

4、以“比值表示：求出被检标本的OD值与一组阴性标本OD值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。

测定标本OD值-空白OD值

阴性对照OD值-空白OD值

如在此测定时以空白校正“O”点。

5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以OD值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被检标本的OD值，从曲线上找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。

作试验时的阴性参考血清最好不要显色，否则会对结果判断带来困难，特别在目测时，当阳性标本OD值>2.0时，应作适当稀释后再作测定。

2.  对使用仪器要求

所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要求标准化。