直接免疫荧光法测抗原

一、基本原理：

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应.其优点是方法简便. 特异性高，非特异性荧光染色少.缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体.此法常用于细菌. 病毒等微生物的快速检查和肾炎活检. 皮肤活检的免疫病理检查。

二、试剂与仪器：

1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01 mol/L，pH7.4

2. 荧光标记的抗体溶液：以0.01 mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

3. 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制

4. 搪瓷桶三只（内有0.01 mol/L，pH7.4的PBS 1500 ml）

5. 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

6. 荧光显微镜

7. 玻片架

8. 滤纸

9. 37℃温箱等

三、实验步骤：

1. 滴加0.01 mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10 min后弃去，使标本保持一定湿度；

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30 min）；

3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01 mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01 mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡；

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖；

5. 立即用荧光显微镜观察.观察标本的特异性荧光强度，一般可用"+"表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮.待检标本特异性荧光染色强度达"++"以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

四、注意事项：

1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够.染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0~2℃的低温，延长染色时间.低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰.

（1）标本自发荧光对照：标本加1~2滴0.01 mol/L，pH7.4的PBS。

（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

（3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3 min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。