🔥 双抗体夹心法（测抗原）

试剂：血清，血浆，体液碳酸盐包被缓冲液，抗体球蛋白，吐温，柠檬酸；

仪器：硫酸酶标比色计，96 孔板，移液枪，离心管，离心管盒

1、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1~10 ug/ml），每凹孔加 0.3 ml，4 ℃ 过夜，或 37 ℃ 水浴 3 小时，贮存冰箱。

2、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。

3、每凹孔加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37 ℃ 作用 1～2 小时。

4、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。

5、加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37 ℃ 作用 1～2 小时或由预试实验确定作用时间。

6、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。

7、加入 0.2 ml 底物溶液于每个凹孔（OPD 或 OT），室温作用 30 分钟（另作一空白对照，0.4 ml 底物加 0.1 ml 终止剂）。

8、加终止剂：每凹孔加 2 M H₂SO₄ 或 2 M 柠檬酸 0.05 ml。

9、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD 用 492 nm）OD 值。

ELISA 的影响因素

1.  固相载体可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。

但在 ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于 ELISA 测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。

实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样，用 0.2 μg/ml 纯化的正常人 IgG 进行包被，经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度（OD 值）。

一般认为全板中每两孔间 OD 值的误差不超过 10% 为合格。如果中间孔与四周孔 OD 值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的 OD 值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清 OD 值是否有明显差别。一般要求有 10 倍左右的差异为合格，微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理。用蒸馏水冲洗即可应用。

2. 抗原在 ELISA 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。

此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。经试验证明，适用于其他血清学试验的抗原并非均适合用于 ELISA 法。因此，对某一疾病的诊断，必须通过实践，才能选出适用的优质抗原。

对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于 ELISA，例如超声波抗原、冻融抗原、细菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、细菌的外毒素以及用表面活性剂 (如 SDS) 所提取的抗原等，在作 ELISA 时，必须要有 1~2 种试剂、要求纯化，但用表面活性剂提取的抗原在包被前必须透析除去表面活性剂，否则就不易吸附到固相载体上去。

此外，对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。

在用特异性抗体包被固相载体时也要提纯。用抗原或抗体蛋白包被固相载体时选择的浓度要适当。如浓度太高，则低效价抗体可能测不出来，或包被过量形成多层抗原吸附，故在操作过程中可能脱落从而降低敏感性和可重复性。

用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。那么用多大浓度抗原进行包被最为合适呢？可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定 OD 值，选择 OD 值 ≥ 1.0 的那个抗原稀释度为最适包被浓度。

一般总是要选择那个 OD 值稍大于 1.0，而不选择小于 1.0 的抗原浓度。阴性参考血清 OD 值要求 0.1~0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的 OD 值有明显差别。抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH 均有关系。温度高（如 37 ℃、45 ℃、或 56 ℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。

但为了方便起见，通常采用 4 ℃ 包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如 0.1 mol/L、PH9.6 碳酸盐缓冲液稀释抗原）4 ℃ 包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用 LPS 或毒素蛋白包被时，用 PH 7.2~7.4 PBS 稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为 1~10 μg/ml，而对某些病原微生物抗原以 5~20 μg/ml 较为合适，但均应通过滴定。