ELISA显色失败都有什么原因？

失败原因：1.包被原：包括你的包被液有无问题，有没有配错。包被原一般加100微升，37度2小时；
2.封闭：封闭液用的是否适合？你说做了几次都没显色，空白孔也不显吗？如果空白也无颜 色，那封闭就没有问题。一般封闭是200微升每孔，也可以满孔封闭
3.一抗：检查你的一抗是否失效。是否是在37度反应
4.二抗：底物，底物缓冲液……这些都要好好检查！
5.洗涤：用PBST洗涤，包被和封闭时洗板3次；一抗二抗洗涤5次，每次间隔3分钟。手工和机器洗涤没什么不同，就是省力一些。洗5次不会有负影响，在一抗和二抗洗涤过程中，恰恰需要多洗几次，这样有助于减少非特异性吸附。

显色失败可能原因：1) 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；2) 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。解决办法：1) 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；2) 加样时保持显色剂不外流；3) A、B液应避免接触金属器械。

在酶联免疫吸附实验过程中，过氧化物酶的加入和中间洗版的过程以及试剂的完整和有效性是非常重要的，要注意酶促底物的标准时间和洗液的配比浓度都正确，注意拍板过程，不能有一些抗氧化的物质，也不能有滑石粉等污染，要注意手套采用一次性手套，才能保证实验结果的准确

1. 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性。可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧（O），从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。所以严重溶血标本禁用。

2. 标本受细菌污染。因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。

3. 标本保存不当。在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA试剂盒测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。