BA-Spot-ELISA法检测抗体形成细胞

[试剂及配制]

（1）包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）

Na2CO3 0.16g
NaHCO3 0.29g
蒸馏水加至100ml

（2）洗涤液（pH7.4PBS-Tween20）

KH2PO4 0.2g
Na2 HPO4-12H20 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tween20 0.5ml
蒸馏水加至1000ml

（3）封闭液（1%BSA pH9.6 碳酸盐缓冲液）

（4）抗原

（5）BiO-Ab和Avi-HRP

[操作方法]

（1）培养板的预处理：在24培养板孔内加0.5ml 0.2%戊二醛（溶于0.1mol/L，pH5.0 PB），37℃，4h，甩去板中的处理液，PBS洗涤3次，每次3min；

（2）抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；

（3）制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出脾脏，置于加有Hanks液的小平皿内，用钝头直角9号注射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；

（4）往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，甩去培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；

（5）往各孔中加入0.5ml生物素化抗体（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，甩去液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

（6）加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，甩去液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；

（7）配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5ml TMB 溶液（4mg/ml甲醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

（8）显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色斑点。