原理
细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现"紫色"的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。
材料与仪器
细胞培养液 酒精
CO2孵育箱 PVDF96孔板
CO2孵育箱 PVDF96孔板
步骤
一、试剂盒内容
PVDF96孔板，室温保存；0.1 ml捕获抗体，4℃保存；0.1 ml生物素标记检测抗体，4℃保存；15 ul亲和素碱性磷酸酶标，4℃保存；0.25 g牛血清白蛋白，4℃保存；0.25 g脱脂乳，4℃保存；11 ml底物缓冲液，4℃保存；11 ml浓缩PBS（10X），室温保存；11 ml浓缩洗涤液（200x），室温保存。
二、试剂的准备
1. 10 ml磷酸缓冲盐（PBS，10X）以90 ml蒸馏水稀释；
2. 0.22 g脱脂乳用11 ml稀释的PBS溶解，最终浓度为2%；
3. 0.22 g BSA溶解于22 ml已稀释的PBS，最终浓度为1%；
4. 10 ml浓缩洗涤液（200x）以1990 ml蒸馏水稀释；
5. 10 ul亲和素碱性磷酸酶以10 ml PBS-1%，BSA稀释；
6. 7 ml酒精以3 ml蒸馏水稀释，最终浓度为70%。
三、Eli-spot操作过程
1. 用100 ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。
2. 倒去酒精，用100 ul PBS洗涤3次。
3. 将100 ul捕获抗体加入10 ml PBS中，混合， 每孔加100 ul， 盖上板盖，4℃过夜。
4. 倒去液体，100 ul PBS洗涤一次。
5. 每孔加入100 ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。
6. 在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
7.用100ul PBS洗涤一次。
8. 每孔加入100 ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。
9. 在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。
10. 每孔加100 ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。
11. 用100 ul洗涤缓冲液洗孔3次。
12. 于10 ml PBS-1%BSA中稀释100 ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100 ul此液体，盖上板盖，37℃下孵育1小时30分。
13. 倒去液体，用100 ul洗涤缓冲液洗3次。
14. 每板以10 ml PBS-1%BSA稀释10 ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100 ul此液体，盖上板盖，37℃孵育1小时。
15. 倒去液体，用100 ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。
16. 每孔加入100 ul BCIP/NBT。
17. 室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。
18. 用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。
此板在室温下避光保存。使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的致癌物质，试验时带手套，使用后适当处理。对MAIPAN4510板，孵育时由于毛细作用，试剂渗入膜中，此液体难以洗去，因此导致背景增加。为了避免此情况，建议在步骤12时将板底移去，将膜倒转，用蒸馏水流冲洗，同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中，由于板底已移去，建议将MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步骤不变。
常见问题
一、酶联免疫斑点技术（ELISPOT）简介
随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：
1. ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
2. ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）
3. 由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。
4. 捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
二、直接的和间接的Eli-spot法
二、直接的和间接的Eli-spot法
可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞（直接法），或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中（间接法）。使用哪种方法基于：1）检测细胞的类型；2）希望得到的细胞量。如果只需少量的细胞因子生成细胞，使用直接法；如果细胞因子生成细胞较多，最好使用间接法。其它步骤一致。
刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。在培养液中稀释PBMC（如：RPMI 1640加2 mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清），其中含1 ng/ml PMA和500 ng/ml娄诺霉素（Sigma， Saint Louis， MO）。加2×104至5×104个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作最佳选择。
来源：丁香实验
