检测人IFNγ的PVDF Elispot法

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酶联免疫斑点法（ELISpot）

试剂盒内容：PVDF96孔板，室温保存;0.1ml捕获抗体，4℃保存;0.1ml生物素标记检测抗体，4℃保存;15ul亲和素碱性磷酸酶标，4℃保存;0.25g牛血清白蛋白，4℃保存;0.25g脱脂乳，4℃保存;11ml底物缓冲液，4℃保存;11ml浓缩PBS (10X)，室温保存;11ml浓缩洗涤液(200x)，室温保存

自备材料/试剂： 细胞培养 液，CO2孵育箱，70%酒精

直接的和间接的Eli-spot法

可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞(直接法)，或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中(间接法)。使用哪种方法基于：1)检测细胞的类型;2)希望得到的细胞量。如果只需少量的细胞因子 生成细胞，使用直接法;如果细胞因子生成细胞较多，最好使用间接法。其它步骤一致。

刺激方法：建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC，使其产生IFNγ。

在培养液中稀释PBMC(如：RPMI 1640加2mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清)，其中含1ng/ml PMA和500ng/ml娄诺霉素(Sigma, Saint Louis, MO)。加2.104至5.104个细胞到抗体包被的PVDF孔，孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同，基于细胞因子生成细胞的量，按不同情况作最佳选择。

试剂的准备：1. 10ml磷酸缓冲盐(PBS，10X)以90ml蒸馏水稀释;2. 0.22g脱脂乳用11ml稀释的PBS溶解，最终浓度为2%;3. 0.22gBSA溶解于22ml已稀释的PBS，最终浓度为1%;4. 10ml浓缩洗涤液(200x)以1990ml蒸馏水稀释;5. 10ul亲和素碱性磷酸酶以10ml PBS-1%,BSA稀释6. 7ml酒精以3ml蒸馏水稀释，最终浓度为70%。

Eli-spot操作过程：

1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。

2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。

3. 3.将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul， 盖上板盖，4℃过夜。

4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。

5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS(见试剂准备)，盖上板盖，室温下孵育2小时。

6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

7.用100ul PBS洗涤一次。

8.每孔加入100ul细胞悬浮液(含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂)。细胞可预先在体外接受刺激(间接Eli-spot)。盖上标准的96孔板塑料板盖，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间(15-20小时)。这期间不要晃动或移动孔板。

9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。

10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。

11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。

12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，37℃下孵育1小时30分。

13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。

14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，37℃孵育1小时。

15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。

16.每孔加入100ul BCIP/NBT。

17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。

18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4℃下放置一夜，点会比较明显。

此板在室温下避光保存。

使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的至癌物质，试验时带手套，使用后适当处理。对MAIPAN4510板，孵育时由于毛细作用，试剂渗入膜中，此液体难以洗去，因此导致背景增加。为了避免此情况，建议在步骤12时将板底移去，将膜倒转，用蒸馏水流冲洗，同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中，由于板底已移去，建议将MAIP4510板放于空的96孔板上，其后的步骤不变。