ELISPOT检测细胞因子IFN-Y

ELISPOT 检测细胞因子 IFN-γ 方法的基本原理是采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）技术检测 Th 细胞在抗原刺激下分泌 IFN-γ 的情况。ELISPOT 的实验设计是在 96 微孔培养盘底部披覆 PVDF 薄膜，用来吸附特殊无毒性 ［不含叠氮钠（sodium azide）、内毒素（endotoxin）］ 的单克隆抗体。静脉血 PBMC 细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。

一般而言，记忆型 T 细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部（在紧靠分泌细胞的周围）分泌出的细胞因子会被 PVDF 薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步与生物素（biotin）标记的二次抗体结合，其后再以结合酵素的 StreptAvidin 与之作用，并加入酵素基质使其呈色，有分泌作用的细胞会留下约 10～20 mm 大小染色的斑点，可以通过 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。在双色标记系统中，可同时检测两种细胞因子的分泌细胞频率。

器材：

细胞培养箱等

试剂：

① PBS

② 抗 IFN-γ 抗体

③ 含 10% 血清的培养基

EELISPOT 检测细胞因子 IFN-γ 方法的基本流程如下：

（1）用 PBS 稀释包被抗体，于 ELISpot 板，每孔加入 10 μl 包被抗体（抗 IFN-γ抗体）溶液，4 ℃ 孵育过夜。甩掉多余抗体，用 PBS 洗板后，每孔加入 200 μl 含 10% 血清的培养基进行封闭，室温孵育 30 分钟。

（2）将用前述方法建立的抗原特异性 CD4^＋T 细胞克隆、刺激后 PBMC 或刺激后 CD4^＋T 细胞铺于已用抗体包被的孔中，每组设 3 复孔。按 1:2～10:1 的比例加入用上述方法制备的 APC。

（3）其余方法同「CTL 活性检测」的 IFN-γ ELISpot 法。