Th细胞表位的鉴定

抗原特异性 CD4＋T 细胞克隆的建立的基本过程可分为如下几步：1．分离获得 TIL、淋巴结细胞、PBMC 采用常规组织淋巴结分离方法如分离淋巴结后，100 目筛网研磨分离获得 TIL 或淋巴结，淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得 PBMC。2．加入 2～10 μg/ml 抗原，37 ℃、5% CO2 培养。1 周后，重复刺激 1 次。3．用与抗原孵育过的、照射后或丝裂霉素 C 处理后 APC 刺激

酸洗脱法获取抗原多肽是指用一定强度的酸性缓冲液可将表位多肽和 β2M 从细胞表面洗脱下来，通过分离、纯化即可获得 Th 细胞表位多肽。

表位预测法获取抗原多肽方法是指特定 Th 细胞表位多肽的氨基酸组成有其特定的规律，因此可以采用计算机预测的方法获取抗原多肽。

交叠肽合成法获取抗原多肽片段方法，是指通过人工合成的方法获得一系列氨基酸交叠的多肽。

亲和层析纯化 MHC II 类分子测定多肽亲和力方法的基本流程如下：（1）将抗 MHC II 类分子单克隆抗体连接到琼脂糖凝胶 CL-4B（Sepharose CL-4B）上，装柱，制成抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱。（2）裂解后的细胞溶液过未活化的 SepharoseCL4-B 柱和蛋白 A-Sepharose 柱 2 次后，过抗体-Sepharose CL-4B 亲和层析柱。

肽结合抑制实验测定多肽亲和力方法的基本流程如下：（1）合成、制备荧光素或 125I 等标记的、能与相应 MHC II 类分子高亲和力结合的已知 Th 细胞表位多肽。（2）在有蛋白酶抑制剂存在的条件下，将目标多肽和 5～500 nmol/L MHC II 类分子、1～10 nmol/L 标记后 Th 细胞表位多肽一起室温孵育 48 小时。过凝胶柱，分离获得 MHC II 类分子-多肽复合物。（3）测

肽特异性 CD4＋T 细胞的诱导方法是指在体外用多肽进行刺激，制备效应细胞，以便后续进行 CTL 活性的检测。这是效应性细胞毒性 T 细胞的体外诱导方法的一种方法，除多肽刺激制备效应性细胞毒性 T 细胞方法外，还可用多肽孵育后 TAP 缺陷细胞刺激、多肽孵育后 DC 刺激法制备效应性细胞毒性 T 细胞。

1．将用前述方法建立的抗原特异性 CD4＋T 细胞克隆、刺激后 PBMC 或刺激后 CD4＋T 细胞铺于 96 孔细胞培养板，每组设 3 复孔。按 1:2～10:1 的比例加入用前述方法制备的 APC。2．共培养 2～5 天后，每孔加入 0.5～1 μ Ci H-胸腺嘧啶核苷（H-thymidine，3'H-TdR），37 ℃、5% CO2 孵育 16 小时。3．收集细胞于玻璃纤维纸上，测定 cp

Th 细胞表位的 MHC 限制性一般通过测定 MHC II 类分子特异性单克隆抗体对抗原诱导的 T 细胞增殖的抑制来确定，其基本方法与细胞增殖实验相同，并与细胞增殖实验同步进行。

酶联免疫吸附实验（ELISA）测定 IFN-γ 细胞因子方法是利用 ELISA 实验测定细胞因子 IFN-γ。

反转录 PCR 测定 IFN-γ 细胞因子方法是利用 RT PCR 技术检测 IFN-γ 细胞因子的一种方法。

ELISPOT 检测细胞因子 IFN-γ 方法是采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）技术检测 Th 细胞在抗原刺激下分泌 IFN-γ 的情况。