材料与仪器
器材:
100 目筛网、离心机等。
试剂:
① 淋巴细胞分离液;
② 2~10 μg/ml 抗原;
③ 丝裂霉素 C;
④ 10~20 IU/ml IL-2。
步骤
抗原特异性 CD4+T 细胞克隆的建立的基本过程可分为如下几步:
1.分离获得 TIL、淋巴结细胞、PBMC 采用常规组织淋巴结分离方法如分离淋巴结后,100 目筛网研磨分离获得 TIL 或淋巴结,淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得 PBMC。
2.加入 2~10 μg/ml 抗原,37 ℃、5% CO2 培养。1 周后,重复刺激 1 次。
3.用与抗原孵育过的、照射后或丝裂霉素 C 处理后 APC 刺激细胞,每 1~2 周刺激 1 次。
4.每次刺激后 1~2 天,加入 10~20 IU/ml IL-2。
5.稀释刺激后细胞,铺于 96 孔细胞培养板(0.3、1、3 或 10 个细胞/孔),加入 IL-2 和 APC 进行刺激。重复刺激 2 次后,进行细胞增殖检测。
6.用上述方法再次刺激阳性克隆,获得抗原特异性 CD4+T 细胞克隆。
来源:丁香实验