间歇循环刺激法制备抗原特异性T细胞克隆

间歇循环刺激法 是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法，即经抗原间隔刺激多个循环。

[材料和试剂]

（1）抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC

（2）抗原

（3）含10％人AB型血清的完全RPMI 1640培养液

（4）细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材。

[操作步骤]

(1)抗原刺激：于24孔培养板加入单个核细胞5×106 /2ml/孔和最适浓度的抗原，置37℃，5％CO2 温箱培养7d。

(2)间歇循环刺激：

①重悬经过抗原刺激的细胞，并经密度梯度离心，收集界面层细胞，用无血清的RPMI-1640洗二次；

②调整细胞浓度至1×106 /ml，加入24孔培养板孔中，同时各孔加入经过照射的自身MNC 4×106 ，以未照射的自身细胞作为饲养细胞和抗原提呈细胞，培养7d；

③同步骤①收集和洗涤细胞；

④调整细胞浓度至1×106 /ml，与2～3×106 新鲜照射的自身MNC及抗原共同培养7d；

⑤重复步骤②～④共3个循环；

⑥收集细胞，通过增殖试验测定抗原的特异性。

(3)T细胞克隆：间歇循环刺激培养的细胞经有限稀释，于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液，同时克隆板孔中加入104 经过照射的自身MNC、IL-2 30U和适当浓度的抗原，同上述条件培养7～10d，显微镜下观察细胞生长情况。

将生长良好的抗原特异性细胞转至24孔板孔中，加入自身饲养细胞和抗原，继续培养7d，传代并经间歇刺激培养。

[注意事项]

（1）上述方法制备的T细胞克隆未区分出CD4+和CD8+T细胞，二者均可能被克隆

（2）在有限稀释之前，IL-2的量不宜过高，否则可能发生T细胞非特异性增殖