细胞克隆形成实验

详细的实验步骤如下：

1、平板克隆实验过程

实验步骤

一、6孔板

1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；

2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔）;

3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；

4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次；

5.每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min；

6.PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。

注意事项

1.每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。

2.染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。

二、平皿

1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清）中备用。

2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

3.置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。

6.去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟

7.用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%

注意事项

平板克隆形成实验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

体外增殖到至少6代以上可以认定细胞克隆成功，这个是时候可以处理单个细胞了，一般7-10天左右。

在对数生长期的时候取细胞处理。