组织块直接培养法（原代细胞培养实验）

【动物】 选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎 1 个。

【实验材料】 每组的超净台中有以下物品： ① 50 ml 配制好的 RPMI1640 培养液 1 瓶；8 ml 小牛血清（FCS) 1 瓶；100 ml 0.25% 胰蛋白酶 1 瓶；PBS (-)1 瓶 ；② 100 ml 灭菌烧杯 2 个； ③ 50 ml 离心筒 2 个 ；④ 灭菌培养皿 1 个，细胞培养瓶 1 个；⑤  1 ml ，200 μl 移液器各 1 支；枪头盒 2 个；无菌玻璃搅拌棒 1 个；⑥ 细胞计数板 1 块； ⑦ 灭好菌的镊子 1 把，剪刀 1 把； ⑧ 酒精灯 1 台；

1) 胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)

2) 将 1－2 个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用 PBS 漂洗。

3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 50 ml 的无菌离心筒中, 加入 40 ml 0.25％ 的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。

4) 在温暖的环境中或置于 37 °C 培养箱中轻轻摇动 15 分钟。

5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌 50 ml 的离心管中，该管内按照每 10 ml 上清加入 1 ml 小牛血清的比例加入牛血清以灭活，胰蛋白酶。

6) 加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的 50 ml 离心筒中，重复步骤 4 和 5。

7) 离心混合的细胞悬液，1200 r/rain，5 分钟，弃上清。

8) 用新鲜的无菌 PBS 重悬沉淀的细胞，按步骤 7 再次离心。

9)用 PBS 反复洗涤细胞直至上清清亮为止。

a．采用认可的方案处死啮齿动物。

b．立即在无菌超净台内用 70％ 乙醇擦洗整个动物。

c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌 PBS 的 100 ml 烧杯中。

f．漂洗胚胎，去掉 PBS。继续用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。