🔥 原代细胞培养实验
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简介
由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养
原理
原代细胞培养 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。
应用
适于做细胞形态、功能和分化等研究。
来源：丁香实验
操作方法
（1）新鲜分离的小鼠结肠组织置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中清洗；（2）将 3～5 cm 结肠肠管套在玻璃棒上，精细镊小心剥离肠神经丛，置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中；（3）4 ℃，356g，离心 30s，重复三次清洗组织；（4）将组织剪碎，置于加入BSA（0.3 mg/mL）和II型胶原酶（1.3 mg/mL）的预热 K-HS 溶液，37℃，消化 60 min；（5）4℃，356 g，离心 8
🔥 小鼠结肠固有层免疫细胞分离（1）小鼠处死后迅速取出结肠，去除肠系膜，将结肠放置于含有冰冷PBS液的无菌培养皿中，沿肠系膜纵向剪开结肠，在PBS中剧烈摇晃，清洗结肠，去除肠腔内容物；（2）将结肠固定在黑色硅胶皿上，精细镊在体视显微镜下迅速分离黏膜层；（3）无菌剪刀将结肠黏膜组织剪成约 1 mm 的碎片，将剪碎的黏膜组织转移置于预热的装有不含钙镁的 HBSS（5% FBS和5 mM EDTA）溶液的无菌培养瓶中，37 ℃，25
🔥 小鼠骨髓来源巨噬细胞分离培养巨噬细胞是目前免疫学研究中的热点细胞，它作为固有免疫的关键成分，在维持机体的稳态，疾病的预防和治疗等方面发挥至关重要的作用。这里以骨髓来源的巨噬细胞为例，以更加专业简洁的分离培养方法，为更好地研究巨噬细胞的生物学功能打下基础。
🔥 小鼠骨髓来源中性粒细胞的分离培养相比于人类的中性细胞从外周血中大量获取，从血液中分离小鼠中性粒细胞则难度比较大。通过改善传统的腹腔注射巯基乙醇技术，应用 Histopaque 1077 和H istopaque 1119 的密度梯度离心可以获得满足实验要求的较高纯度中性粒细胞。
🔥 小鼠原代结肠上皮细胞分离培养（1）C57BL/6 小鼠颈椎脱臼处死，喷适量酒精，滴加适量 Buffer 快速分离结肠；（2）沿肠系膜剪开，DMEM 培养基清洗去除肠腔内容物；（3）无菌剪刀将结肠组织剪成 1mm3 左右碎片；（4）10 mL 0.1% 胶原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化组织，37℃，摇床消化 25 min；（5）吹打混匀，100 μm 细胞过滤器过滤，收集上清；（6）相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞
组织块直接培养法（原代细胞培养实验）1) 胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)2) 将 1－2 个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用 PBS 漂洗。3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 50 ml 的无菌离心筒中, 加入 40 ml 0.25％ 的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。4) 在温暖的环境中或置于 37 °C 培养箱中轻轻摇动 15 分钟。5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降
培养细胞不贴壁怎么办？原代细胞的培养一般需要在培养器皿中预包被一层促贴壁的物质，如 1 型鼠尾胶原，其对细胞及后续提取蛋白没有影响。
细胞生长不好/生长缓慢怎么办？看细胞密度及是否污染。若细胞密度不够导致生长缓慢，需要增加细胞接种密度， 或将细胞从大皿转至小皿培养，或试着提高血清浓度；若细胞受轻度污染，则可多加点抗生素。
如何防止细胞污染？首先，全程注意无菌操作；其次，所用器材高压灭菌，试剂若不是无菌则需要 0.22 μm 水系或有机系过滤器进行灭菌；最后，可在培养基中加入 1% 的双抗，防止污染。
BMDC 提取与培养需要注意的事项？BMDC 的培养注意事项：1. 小鼠品系和性别：目前培养 BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性 C57BL/6 小鼠。2. 单独使用 GM-CSF 还是联合使用 IL-4？GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 的成熟度高于 GM-CSF 单独诱导的 BMDC。3. 成熟诱导剂的选择：LPS 和 CD40L 均是 DC 体外完全成熟的强诱导剂，CD40L 诱导成熟的 BMDC 在体内显示出
原代细胞分离培养（小鼠结肠细胞为例）（1）C57BL/6 小鼠颈椎脱臼处死，喷适量酒精，滴加适量 Buffer 快速分离结肠；（2）沿肠系膜剪开，DMEM 培养基清洗去除肠腔内容物；（3）无菌剪刀将结肠组织剪成 1mm3左右碎片；（4）10 mL 0.1% 胶原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化组织，37℃，摇床消化 25 min；（5）吹打混匀，100 μm 细胞过滤器过滤，收集上清；（6）相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞；
