🔥 原代细胞培养实验

（1）新鲜分离的小鼠结肠组织置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中清洗；（2）将 3～5 cm 结肠肠管套在玻璃棒上，精细镊小心剥离肠神经丛，置于无菌冰冷的 HBSS 溶液中；（3）4 ℃，356g，离心 30s，重复三次清洗组织；（4）将组织剪碎，置于加入BSA（0.3 mg/mL）和II型胶原酶（1.3 mg/mL）的预热 K-HS 溶液，37℃，消化 60 min；（5）4℃，356 g，离心 8

（1）小鼠处死后迅速取出结肠，去除肠系膜，将结肠放置于含有冰冷PBS液的无菌培养皿中，沿肠系膜纵向剪开结肠，在PBS中剧烈摇晃，清洗结肠，去除肠腔内容物；（2）将结肠固定在黑色硅胶皿上，精细镊在体视显微镜下迅速分离黏膜层；（3）无菌剪刀将结肠黏膜组织剪成约 1 mm 的碎片，将剪碎的黏膜组织转移置于预热的装有不含钙镁的 HBSS（5% FBS和5 mM EDTA）溶液的无菌培养瓶中，37 ℃，25

巨噬细胞是目前免疫学研究中的热点细胞，它作为固有免疫的关键成分，在维持机体的稳态，疾病的预防和治疗等方面发挥至关重要的作用。这里以骨髓来源的巨噬细胞为例，以更加专业简洁的分离培养方法，为更好地研究巨噬细胞的生物学功能打下基础。

相比于人类的中性细胞从外周血中大量获取，从血液中分离小鼠中性粒细胞则难度比较大。通过改善传统的腹腔注射巯基乙醇技术，应用 Histopaque 1077 和H istopaque 1119 的密度梯度离心可以获得满足实验要求的较高纯度中性粒细胞。

（1）C57BL/6 小鼠颈椎脱臼处死，喷适量酒精，滴加适量 Buffer 快速分离结肠；（2）沿肠系膜剪开，DMEM 培养基清洗去除肠腔内容物；（3）无菌剪刀将结肠组织剪成 1mm3 左右碎片；（4）10 mL 0.1% 胶原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化组织，37℃，摇床消化 25 min；（5）吹打混匀，100 μm 细胞过滤器过滤，收集上清；（6）相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞

1) 胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)2) 将 1－2 个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用 PBS 漂洗。3) 在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一 50 ml 的无菌离心筒中, 加入 40 ml 0.25％ 的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。4) 在温暖的环境中或置于 37 °C 培养箱中轻轻摇动 15 分钟。5) 让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降

原代细胞的培养一般需要在培养器皿中预包被一层促贴壁的物质，如 1 型鼠尾胶原，其对细胞及后续提取蛋白没有影响。

看细胞密度及是否污染。若细胞密度不够导致生长缓慢，需要增加细胞接种密度， 或将细胞从大皿转至小皿培养，或试着提高血清浓度；若细胞受轻度污染，则可多加点抗生素。

首先，全程注意无菌操作；其次，所用器材高压灭菌，试剂若不是无菌则需要 0.22 μm 水系或有机系过滤器进行灭菌；最后，可在培养基中加入 1% 的双抗，防止污染。

BMDC 的培养注意事项：1. 小鼠品系和性别：目前培养 BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性 C57BL/6 小鼠。2. 单独使用 GM-CSF 还是联合使用 IL-4？GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 的成熟度高于 GM-CSF 单独诱导的 BMDC。3. 成熟诱导剂的选择：LPS 和 CD40L 均是 DC 体外完全成熟的强诱导剂，CD40L 诱导成熟的 BMDC 在体内显示出

（1）C57BL/6 小鼠颈椎脱臼处死，喷适量酒精，滴加适量 Buffer 快速分离结肠；（2）沿肠系膜剪开，DMEM 培养基清洗去除肠腔内容物；（3）无菌剪刀将结肠组织剪成 1mm3左右碎片；（4）10 mL 0.1% 胶原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化组织，37℃，摇床消化 25 min；（5）吹打混匀，100 μm 细胞过滤器过滤，收集上清；（6）相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞；