🔥 小鼠原代结肠上皮细胞分离培养

原代提取目的细胞会混杂着大量的其它细胞，通过不同生物酶的梯度消化、差速贴壁等能够得到纯度较高的目的细胞群。胶原酶是一种从细菌中提取的酶，对胶原消化作用强，适用于纤维组织及上皮组织的消化，其中胶原酶 I 和分散酶 II 消化结肠组织时可以使细胞间质的脯氨酸多肽水解，达到分散细胞，而不影响上皮细胞的效果，采用相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞可获得纯度较高的结肠上皮细胞。

含有双抗的 DMEM 培养基、5 g/L 胰蛋白酶，Buffer 溶液（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10mM HEPES），消化液（DMEM 培养基溶解胶原酶 I 浓度为 0.1%，分散酶 II 浓度为 0.3%）

无菌剪刀、无菌镊子、100 μm 细胞过滤器、细胞培养瓶、细胞培养板；

（1）C57BL/6 小鼠颈椎脱臼处死，喷适量酒精，滴加适量 Buffer 快速分离结肠；

（2）沿肠系膜剪开，DMEM 培养基清洗去除肠腔内容物；

（3）无菌剪刀将结肠组织剪成 1mm³ 左右碎片；

（4）10 mL 0.1% 胶原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化组织，37℃，摇床消化 25 min；

（5）吹打混匀，100 μm 细胞过滤器过滤，收集上清；

（6）相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞；

（7）加入 1 mL 培养基重悬细胞，接种于培养瓶完全培养基中，37℃，5% CO₂ 细胞培养箱中培养；

（8）细胞长至培养瓶 80-90% 后用 5 g/L 的胰酶消化液消化，接种于细胞培养板。

1. 实验前所有器械消毒，高压灭菌，液体无菌过滤；

2. 酶消化液现用现配；

3. 实验中注意充分消化以保证检测细胞量足够；

4. 尽可能充分去除成纤维细胞；

5. 用于后续培养需保证全程无菌操作。