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🔥 小鼠骨髓来源中性粒细胞的分离培养

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别名:Isolation and culture of mouse bone marrow-derived neutrophils

最新修订时间:

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合作专家 | 孙齐博士

生理学 首都医科大学

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审核专家 | 聂壹峰博士

纳米生物医学 中国科学院大学

简介

相比于人类的中性细胞从外周血中大量获取,从血液中分离小鼠中性粒细胞则难度比较大。通过改善传统的腹腔注射巯基乙醇技术,应用 Histopaque 1077 和H istopaque 1119 的密度梯度离心可以获得满足实验要求的较高纯度中性粒细胞。

原理

小鼠骨髓相比于腹腔和血液,是一个巨大的中性粒细胞储存库,中性粒细胞作为先天免疫系统中丰度较高的细胞,参与天然免疫并调节适应性免疫。

用途

骨髓中的中性粒细胞已被证明可以替代血液中的中性细胞,用于培养研究。

材料与仪器

【溶液与试剂】

C57BL/6 小鼠、含 10% FBS 的 1640 培养基、75% 酒精、9% 生理盐水、无菌 PBS、Histopaque 1077、Histopaque 1119

【仪器与耗材】

无菌剪刀、无菌镊子、70 μm细胞过滤器、细胞培养板

步骤

(1)小鼠颈椎脱臼处死,喷洒酒精消毒迅速分离股骨和胫骨,尽可能完全地去除肌肉组织;

(2)将股骨和胫骨收集到预冷 10% FBS 1640 培养基,在冰上进行下游操作;

(3)用无菌 PBS 冲洗三次,9% 的生理盐水浸泡股骨和胫骨,两端剪去,暴露骨髓腔;

(4)生理盐水反复冲洗骨髓腔,70 μm 细胞过滤器过滤骨髓冲洗液;

(5)离心,室温 1200 rpm,5 min,弃上清;

(6)生理盐水重悬,加入 Histopaque 1077 中;

(7)离心,4℃,2000 rpm,20 min;

(8)弃去上层物质,生理盐水重悬,加入到 Histopaque 1119 中;

(9)离心,4℃,2000 rpm,20 min;

(10)小心吸取中间层液体,生理盐水重悬稀释;

(11)轻柔混匀,离心,4℃,1500 rpm,10 min;

(12)弃上清,1640 完全培养基重悬细胞于细胞培养板,CO2 培养箱分离培养。

注意事项

1. 实验前所有器械消毒,高压灭菌,液体无菌过滤;

2. 生理盐水冲洗骨髓腔时,要冲至骨髓腔发白;

3. 用于后续培养需保证全程无菌操作;

4. 生理盐水细胞重悬液与 Histopaque 1077 的体积比为 1:3,加入时需沿管壁缓慢加入;

5. 生理盐水细胞重悬液与 Histopaque 1119 的体积比 1:2,加入时需沿管壁缓慢加入;

6. 云雾状的中间层液体即为中性粒细胞所在,吸取液体与加入生理盐水的体积比为 1:5。

来源:丁香实验

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